EZ poly?RNA轉(zhuǎn)染試劑
產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 包裝規(guī)格 |
NBS9425-0.5ml | EZ poly?RNA轉(zhuǎn)染試劑 | 0.5ml |
NBS9425-1ml | EZ poly?RNA轉(zhuǎn)染試劑 | 1ml |
NBS9425-5ml | EZ poly?RNA轉(zhuǎn)染試劑 | 5x1ml |
產(chǎn)品簡介:
EZ poly?RNA轉(zhuǎn)染試劑是一款新型、性能穩(wěn)定的siRNA專用轉(zhuǎn)染試劑，它具有較強(qiáng)的壓縮RNA的能力，能夠把RNA高效率、迅速地轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞之中，而不被核酸酶降解。與其他轉(zhuǎn)染試劑相比，具有毒性低、穩(wěn)定性好、耐血清能力強(qiáng)、轉(zhuǎn)染簡單易行、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。
應(yīng)用范圍:
EZ poly?RNA轉(zhuǎn)染試劑可適用于眾多原代培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化細(xì)胞株的siRNA轉(zhuǎn)染。沉默效率高且性能穩(wěn)定，在有無血清存在的細(xì)胞培養(yǎng)基中均能獲得非常理想的基因沉默效果。
保存條件:
2-8℃保存一年
運(yùn)輸：
常溫運(yùn)輸
siRNA的轉(zhuǎn)染:
以24孔板為例，請參考表1的轉(zhuǎn)染規(guī)模調(diào)整，步驟如下:
1 | 細(xì)胞接種: 每孔接種0.5~1.0×105個細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)12~24小時，使轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度達(dá)到60~70%融合度 |
2 | siRNA稀釋: 將15pmol的siRNA稀釋于Opti-MEM培養(yǎng)基中，終體積10 μL |
3 | 轉(zhuǎn)染試劑稀釋: 取1μL的EZ poly?RNA轉(zhuǎn)染試劑加入到9μL的 Opti-MEM培養(yǎng)基中，稀釋后的終體積為10μL |
4 | 復(fù)合物制備：將上述siRNA稀釋液和轉(zhuǎn)染試劑稀釋液混合，輕輕吹打均勻后，室溫靜置10分鐘 |
5 | 將上述20μL復(fù)合物加入到24孔板中，輕輕吹打混勻，繼續(xù)培養(yǎng)18~48小時后檢測轉(zhuǎn)染效率，無需更換培養(yǎng)基 |
siRNA轉(zhuǎn)染的優(yōu)化:
可通過改變細(xì)胞密度、siRNA濃度以及EZ poly?RNA濃度對轉(zhuǎn)染進(jìn)行優(yōu)化。保證細(xì)胞融合度在60%以上，EZ poly?RNA (μL): siRNA(pmol)可以在0.02:1和0.15:1之間調(diào)整。
表1. 不同培養(yǎng)板所需轉(zhuǎn)染試劑和siRNA的用量
培養(yǎng)板 | 單孔面積 | 接種 培養(yǎng)基 |
Opti-MEM 稀釋后終體積 | siRNA轉(zhuǎn)染 |
試劑用量 | siRNA |
96孔板 | 0.3cm2 | 200μL | 10μL | 0.5μL | 7.5pmol |
24孔板 | 2.0cm2 | 500μL | 20μL | 1.0μL | 15pmol |
12孔板 | 4.0cm2 | 1mL | 40μL | 2.0μL | 30pmol |
6孔板 | 10.0cm2 | 2mL | 100μL | 4.0μL | 60pmol |
一：轉(zhuǎn)染效率低
影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的因素有很多。首先，與所轉(zhuǎn)染細(xì)胞有關(guān)，有的細(xì)胞容易轉(zhuǎn)染，如HeLa、B16F10、293T等。有的細(xì)胞不易轉(zhuǎn)染，如4T1、NIH3T3、BMDC等。其次，與轉(zhuǎn)染試劑的用量及與DNA的比例有關(guān)，在最佳的轉(zhuǎn)染比例附近可以達(dá)到最佳的轉(zhuǎn)染效果。最后，沒有使用最適宜的細(xì)胞密度，應(yīng)根據(jù)各種轉(zhuǎn)染試劑的說明書中推薦的細(xì)胞密度進(jìn)行細(xì)胞接種，更有利于提高轉(zhuǎn)染效率。
二：轉(zhuǎn)染效果不穩(wěn)定，不能重現(xiàn)
轉(zhuǎn)染效果不穩(wěn)定一般與兩個因素緊密相關(guān)，一個是轉(zhuǎn)染試劑的穩(wěn)定性，另一個是基因的穩(wěn)定性。轉(zhuǎn)染試劑應(yīng)按照說明書建議的保存溫度及條件進(jìn)行保存。如使用脂質(zhì)體類的轉(zhuǎn)染試劑，則不建議反復(fù)凍融，會引起該轉(zhuǎn)染試劑結(jié)構(gòu)上的變化?；蛉缍虝r間內(nèi)連續(xù)使用，可放置于4℃保存。若超過10天不使用，建議置于-20℃或-80℃長期儲存以降低核酸的降解速度。
三：細(xì)胞毒性大
導(dǎo)致轉(zhuǎn)染時細(xì)胞毒性大的因素有很多，例如DNA的用量過大、轉(zhuǎn)染試劑的用量過大、轉(zhuǎn)染時細(xì)胞狀態(tài)較差以及培養(yǎng)基中抗生素的加入等。建議嚴(yán)格按照所選擇轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行操作，以避免細(xì)胞毒性大的問題。
四：沒有生成高效率的DNA轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物
沒有生成高效復(fù)合物的因素有很多。首先，可能是沒有選對合適的轉(zhuǎn)染試劑。挑選轉(zhuǎn)染試劑時應(yīng)考慮基因的種類及分子量等因素。其次，有的轉(zhuǎn)染試劑對血清的影響很大，應(yīng)在無血清情況下進(jìn)行轉(zhuǎn)染。使用諾寧生物的EZ poly? 系列轉(zhuǎn)染試劑無需考慮血清對轉(zhuǎn)染體系的影響，可在含血清培養(yǎng)基中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
五：使用錯誤的轉(zhuǎn)染操作步驟
無論使用哪一款基因轉(zhuǎn)染試劑，都應(yīng)嚴(yán)格按照該轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行操作，其中包括轉(zhuǎn)染試劑的用量、基因用量、最佳轉(zhuǎn)染比例、孵育時間、檢測時間等重要因素。
六：轉(zhuǎn)染試劑有時呈云霧狀渾濁
如發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染試劑出現(xiàn)云霧狀渾濁應(yīng)立即聯(lián)系客服人員?；蜣D(zhuǎn)染試劑一般都呈清澈透明狀態(tài)，呈云霧狀渾濁可能是由于轉(zhuǎn)染試劑發(fā)生了污染或儲存溫度太低，請務(wù)必按照試劑說明書要求的溫度進(jìn)行儲存。如出現(xiàn)此現(xiàn)象，建議溫浴10分鐘后，觀察是否澄清。
七：轉(zhuǎn)染復(fù)合物出現(xiàn)沉淀
當(dāng)轉(zhuǎn)染試劑和基因的用量都高于說明書用量，或復(fù)合物的孵育體系體積小于說明書建議時，由于體系中過量的電荷發(fā)生了聚集會導(dǎo)致體系中的復(fù)合物出現(xiàn)沉淀。建議要嚴(yán)格參考說明書的用量進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
八：siRNA轉(zhuǎn)染時，基因沉默效率不夠高
影響siRNA沉默效率的因素很多，如基因本身是否被環(huán)境中的RNA酶污染降解？或所使用的細(xì)胞是否為難轉(zhuǎn)染細(xì)胞？以及是否按照說明書建議的用量進(jìn)行了操作等。首先應(yīng)該選擇合適的siRNA基因轉(zhuǎn)染試劑，確保細(xì)胞密度在60-70%之間，并嚴(yán)格按照說明書建議的用量去使用操作。
九：DNA-siRNA共轉(zhuǎn)染時，基因沉默效率不夠高
當(dāng)細(xì)胞同時轉(zhuǎn)染DNA和siRNA時，建議使用分別轉(zhuǎn)染的方式進(jìn)行。即使用基因轉(zhuǎn)染試劑分別與DNA和siRNA進(jìn)行復(fù)合，再將兩個復(fù)合物體系分兩次分別加入到同一個裝有細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)孔中。因DNA和RNA的轉(zhuǎn)染機(jī)理不相同，如只想使用一種轉(zhuǎn)染試劑同時轉(zhuǎn)染兩種基因，建議一定要使用通用型基因轉(zhuǎn)染試劑，如EZ poly? 系列的DNA/RNA產(chǎn)品，即可以轉(zhuǎn)染DNA又可以轉(zhuǎn)染RNA。
