Porcine Intestinal Organoid Kit 豬小腸類器官培養(yǎng)試劑盒

貨號：K2269-PI

規(guī)格：100ml

500ml

品牌：bioGenous

產(chǎn)品介紹

bioGenous^TMPorcine Intestinal Organoid Kit（豬小腸類器官培養(yǎng)試劑盒）是一款用于建立和維持豬小腸干細胞來源類器官的完全培養(yǎng)基。生長在該完全培養(yǎng)基中的豬小腸類器官主要由腸干細胞、腸祖細胞和腸絨毛細胞、潘氏細胞、杯狀細胞和少量腸內(nèi)分泌細胞組成，在自我更新能力、組織結(jié)構(gòu)、細胞類型和功能方面，豬小腸類器官重現(xiàn)了體內(nèi)小腸上皮的特征，因此是腸道體外研究的理想體外模型。

技術參數(shù)

產(chǎn)品信息：

豬小腸類器官完全培養(yǎng)基的制備

使用無菌操作技術配制豬小腸類器官完全培養(yǎng)基，以配制10 mL為例，如所需量不同，可相應調(diào)整用量。

1.         冰上解凍Porcine Intestinal Organoid Supplement B (50x)和Porcine Intestinal Organoid Supplement C (250x)。

注意：解凍后，建議將Porcine Intestinal Organoid Supplement B (50x)和Porcine Intestinal Organoid Supplement C (250x) 分別分裝后保存取用，避免反復凍融。

2.         將200 μL Porcine Intestinal Organoid Supplement B (50x)，40 μL Porcine Intestinal Organoid Supplement C (250x) 加至9.76 mL Porcine Intestinal Organoid Basal Medium中，充分混合，配制成10 mL豬小腸類器官完全培養(yǎng)基。

注意：配制后的豬小腸類器官完全培養(yǎng)基可在2 - 8°C儲存，建議在兩周內(nèi)使用。Porcine Intestinal Organoid Supplement B(50x)內(nèi)含有細菌及真菌抗生素(50x)。

豬小腸類器官原代培養(yǎng)

1.         依據(jù)所在單位批準的實驗動物倫理及操作規(guī)范進行動物組織取材，取材后的組織須在2 - 8℃組織保存液或DPBS中迅速轉(zhuǎn)運至潔凈實驗室進行組織處理和干細胞分離。

2.         準備若干培養(yǎng)皿，加入4℃預冷的DPBS備用。

3.         標準手術操作分離豬腸組織，根據(jù)實驗需求取總長度1 - 10 cm的小腸段，置于含DPBS的培養(yǎng)皿中。

4.         于生物安全柜中使用移液管將小腸一端注入DPBS以沖洗腸內(nèi)容物，沖洗后置于新的含DPBS的培養(yǎng)皿中，反復沖洗數(shù)次至內(nèi)容物完全被沖洗干凈，置于新的含DPBS的培養(yǎng)皿中。

5.         使用手術剪將腸管剪開，腸腔面朝上，一只手持手術鑷夾住腸組織一端，另一只手持手術刀片輕輕刮去腸腔表面腸絨毛，待腸絨毛被刮凈后，將腸組織置于新的含DPBS的培養(yǎng)皿中清洗，重復清洗一次。

6.         將清洗后的小腸組織剪碎至約2 mm長寬，并轉(zhuǎn)移至5-10 mL含有2 mM EDTA的預冷DPBS中消化，4℃孵育30min。

7.         消化完成后，將組織碎片轉(zhuǎn)移到新的含DPBS的培養(yǎng)皿中清洗，重復一次以去除EDTA。

8.         用5 mL移液管在含冷的DPBS的培養(yǎng)皿或50 mL離心管中吹打、重懸組織碎片，使組織反復穿過移液管尖以產(chǎn)生機械剪切力從而使隱窩與基底層分離，取一部分懸液鏡檢，當可以看到大量的隱窩樣結(jié)構(gòu)后，停止吹打并將吹打后的組織懸液通過70μm濾器過濾。

9.         收集濾液，300×g，4℃離心3 min。

10.     棄上清，使用1 mLDPBS重懸組織沉淀，取20 μL懸液進行鏡檢和隱窩計數(shù)，計數(shù)完成后吸取包含所需隱窩量的懸液，300×g，4℃離心3 min，棄上清后置于冰上預冷。

11.     用適量的Matrigel重懸組織沉淀，推薦重懸密度為每25 μL Matrigel懸液包含100 - 500個隱窩，重懸后置于冰上，重懸時間不超過30 s以避免Matrigel過早凝固。

注意：Matrigel 稀釋比例應在70%以上以保證培養(yǎng)過程中Matrigel的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

12.     將Matrigel和組織細胞小心均勻混合以防止氣泡產(chǎn)生并將懸液加入24孔板，25μL每孔滴加在孔底中心，避免懸液接觸孔板側(cè)壁。

注意：為防止Matrigel室溫凝固，此步驟應盡快完成。

13.     將接種完成后的培養(yǎng)板置于37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育15min左右待Matrigel凝固后取出。

14.     提前配制豬小腸類器官完全培養(yǎng)基。

注意：原代或細胞分選后的類器官建立，需要在前2 d的培養(yǎng)體系中加入10 μM的Y27632。

15.     每孔沿孔壁加入500 μL提前預熱的豬小腸類器官完全培養(yǎng)基，再向24孔板最外周孔中每孔加入500 μL無菌水，置于37℃溫箱、5% CO₂條件下培養(yǎng)。

注意：請沿孔壁緩慢加入，避免破壞已凝固結(jié)構(gòu)。

16.     每 3 d更換一次培養(yǎng)基，更換培養(yǎng)基時應避免破壞Matrigel。

17.     密切監(jiān)測類器官生長狀態(tài)，理想情況下應在5 - 7 d內(nèi)建成。

豬小腸類器官傳代培養(yǎng)

1.         用經(jīng)過Anti-Adherence Rinsing Kit (E238002)潤洗的槍頭吹打刮取類器官，并將類器官和培養(yǎng)基的懸液轉(zhuǎn)移至經(jīng)過Anti-Adherence Rinsing Kit潤洗的1.5mL EP管中。

2.         用經(jīng)過Anti-Adherence Rinsing Kit潤洗的槍頭用力重懸類器官懸浮液，多次吹打使得類器官與Matrigel分離。

3.         300×g，4℃離心3 min，棄上清，用經(jīng)過Anti-Adherence Rinsing Kit潤洗的槍頭加入200 μLOrganoid Dissociation Solution（E238001）并充分混勻，37℃條件下消化1 - 3 min，消化結(jié)束后加入1 mL Epithelial Organoid Basal Medium 吹打混勻。

4.         300×g，4℃離心3 min，棄上清，再次加入1 mL Epithelial Organoid Basal Medium 并混勻。

5.         300×g，4℃再次離心3min，棄上清后置于冰上。

6.         用適量的Matrigel重懸類器官沉淀，重懸后置于冰上，重懸時間不超過30 s以避免Matrigel過早凝固。

注意：Matrigel 稀釋比例應在70%以上以保證培養(yǎng)過程中Matrigel的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

7.         將Matrigel和類器官的混合懸液點入24孔板底部正中央，避免懸液接觸孔板側(cè)壁，每孔30μL左右。

注意：為防止Matrigel室溫凝固，此步驟應盡快完成。

8.         將接種完成后的培養(yǎng)板至于37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育15min左右待Matrigel凝固后取出。

9.         配制豬小腸類器官完全培養(yǎng)基。

10.     待Matrigel完全凝固后，沿孔壁加入提前預熱的豬小腸類器官完全培養(yǎng)基，24孔板每孔500μL。

11.     將24孔板置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長出新的類器官之后可進行后續(xù)實驗。