Mouse Intestinal Organoid Kit 小鼠小腸類器官試劑盒

貨號(hào)：K2001-MI

規(guī)格：100ml

500ml

品牌：bioGenous

產(chǎn)品介紹

bioGenous^TMMouse Intestinal Organoid Kit（小鼠小腸類器官試劑盒）是一款用于建立和維持小鼠腸道成體干細(xì)胞來(lái)源小腸類器官的完全培養(yǎng)基。生長(zhǎng)在該完全培養(yǎng)基中的小鼠小腸類器官主要由干細(xì)胞、腸祖細(xì)胞和腸絨毛細(xì)胞、潘氏細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和少量腸內(nèi)分泌細(xì)胞組成，在自我更新能力、組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞類型和功能方面，小鼠小腸類器官重現(xiàn)了體內(nèi)小腸上皮的特征，因此是腸道穩(wěn)態(tài)和疾病機(jī)制研究的理想體外模型。

技術(shù)參數(shù)

產(chǎn)品信息:

小鼠小腸類器官完全培養(yǎng)基的制備：

使用無(wú)菌操作技術(shù)配制小鼠小腸類器官完全培養(yǎng)基。以下是準(zhǔn)備10mL完全培養(yǎng)基的示例，如所需量不同，可相應(yīng)調(diào)整用量。

1.       冰上解凍Mouse Intestinal Organoid Supplement B (50x)和Mouse Intestinal Organoid Supplement C (250x)。

注意：解凍后，建議將Mouse Intestinal Organoid Supplement B (50x)和Mouse Intestinal Organoid Supplement C (250x) 分別分裝后保存取用，避免反復(fù)凍融。

2.       將200uL Mouse Intestinal Organoid Supplement B (50x)，40uL Mouse Intestinal Organoid Supplement C (250x)加至9.76mLMouse Intestinal Organoid Basal Medium中，充分混合，配制成10mL小鼠小腸類器官完全培養(yǎng)基。

注意：配制后的小鼠小腸類器官完全培養(yǎng)基可在2-8°C儲(chǔ)存，建議在兩周內(nèi)使用。Mouse Intestinal Organoid Supplement B(50x)內(nèi)含有細(xì)菌及真菌抗生素(50x)。

小鼠小腸類器官原代培養(yǎng)

1.       依據(jù)所在單位批準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理及操作規(guī)范犧牲小鼠。

2.       準(zhǔn)備若干培養(yǎng)皿，加入4℃預(yù)冷的DPBS備用。

3.       標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)操作取小鼠小腸，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求取總長(zhǎng)度約3厘米至20厘米的小腸段，置于含DPBS的培養(yǎng)皿中。

4.       使用移液管或者注射器往小腸一端注入DPBS以沖洗腸內(nèi)容物，沖洗后置于新的含DPBS的培養(yǎng)皿中，重復(fù)沖洗數(shù)次至內(nèi)容物完全被沖洗干凈，置于新的含DPBS的培養(yǎng)皿中。

5.       使用手術(shù)剪將腸管剪開(kāi)，腸腔面朝上，一只手使用手術(shù)鑷夾住腸組織一端，另一只手使用手術(shù)刀片輕輕刮去腸腔表面腸絨毛，待腸絨毛被刮凈后，將腸組織置于新的含DPBS的培養(yǎng)皿中清洗，重復(fù)清洗一次。

6.       將清洗后的小腸組織剪碎至2mm寬，并轉(zhuǎn)移至含有5mmol/L EDTA的預(yù)冷DPBS中消化，置于4℃孵育30min。

7.       消化完成后，將組織碎片轉(zhuǎn)移到新的含DPBS的培養(yǎng)皿中清洗，重復(fù)一次以去除EDTA。

8.       用5mL移液管在含冷的DPBS的培養(yǎng)皿或50mL離心管中吹打、重懸組織碎片，使組織反復(fù)穿過(guò)移液管尖以產(chǎn)生機(jī)械剪切力從而使隱窩與基底層分離，取一部分懸液鏡檢，當(dāng)可以看到大量的隱窩樣結(jié)構(gòu)后，停止吹打，并對(duì)吹打后的組織懸液進(jìn)行70μm濾網(wǎng)過(guò)濾。

9.       收集穿過(guò)濾網(wǎng)的組織懸液，150g離心力4℃離心3min。

10.    棄上清，使用1mLDPBS重懸組織沉淀，取20uL懸液進(jìn)行鏡檢和隱窩計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)完成后吸取包含所需隱窩量的懸液，150g離心力4℃離心3min，棄上清后置于冰上。

11.    用適量的 Matrigel重懸組織沉淀，推薦重懸密度為每10uL Matrigel懸液包含200至600個(gè)隱窩，重懸后置于冰上，重懸時(shí)間不超過(guò)30s以避免Matrigel過(guò)早凝固。

注意： Matrigel 稀釋比例應(yīng)在70%以上以保證培養(yǎng)過(guò)程中Matrigel的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

12.    將Matrigel和組織細(xì)胞的混合懸液點(diǎn)入24孔板底部正中央，每孔30uL左右，避免懸液接觸孔板側(cè)壁。

注意：為防止Matrigel室溫凝固，此步驟應(yīng)盡快完成。

13.    將接種完成后的培養(yǎng)板至于37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育15min左右待Matrigel凝固。

14.    配制小鼠小腸類器官完全培養(yǎng)基。

15.    待Matrigel完全凝固后，加入已配制好的小鼠小腸類器官完全培養(yǎng)基，24孔板每孔500uL。

注意：請(qǐng)沿壁緩慢加入，避免破壞已凝固結(jié)構(gòu)。

16.    將24孔板置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

17.    每 3 天更換一次培養(yǎng)基，更換培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)避免破壞Matrigel。

18.    密切監(jiān)測(cè)類器官生長(zhǎng)狀態(tài)，理想情況下，小鼠小腸類器官應(yīng)在5至7天內(nèi)建成。

小鼠小腸類器官傳代培養(yǎng)

19.    用經(jīng)過(guò)Anti-Adherence Rinsing Kit (E238002)潤(rùn)洗的槍頭吹打刮取類器官，并將類器官和培養(yǎng)基的懸液轉(zhuǎn)移至經(jīng)過(guò)Anti-Adherence Rinsing Kit潤(rùn)洗的1.5mL EP管中。

20.    用經(jīng)過(guò)Anti-Adherence Rinsing Kit潤(rùn)洗的槍頭用力重懸類器官懸浮液，使得類器官與Matrigel分離。

21.    150g離心力4℃離心3min，棄上清，使用DPBS重懸底部類器官沉淀，150g離心力4℃再次離心3min，棄上清后置于冰上。

22.    用適量的 Matrigel重懸類器官沉淀，重懸后置于冰上，重懸時(shí)間不超過(guò)30s以避免Matrigel過(guò)早凝固。

注意： Matrigel 稀釋比例應(yīng)在70%以上以保證培養(yǎng)過(guò)程中Matrigel的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

23.    將Matrigel和類器官的混合懸液點(diǎn)入24孔板底部正中央，避免懸液接觸孔板側(cè)壁，每孔30uL左右。

注意：為防止Matrigel室溫凝固，此步驟應(yīng)盡快完成。

24.    將接種完成后的培養(yǎng)板至于37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育15min左右待Matrigel凝固。

25.    配制小鼠小腸類器官完全培養(yǎng)基。

26.    待Matrigel完全凝固后，加入已配制好的小鼠小腸類器官完全培養(yǎng)基，24孔板每孔500uL。

27.    將24孔板置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。