X-Gluc 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸環(huán)己胺鹽（X-beta-D- glucuronide CHA salt）

——轉(zhuǎn)基因植物最常用報(bào)告基因GUS顯色底物，GUS染色定性研究

X-Gluc 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸環(huán)己胺鹽

NBS2004-100MG

NBS2004-1G

NBS2004-5G

品牌：NoninBio

作用機(jī)制：

X-Gluc，也稱為5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸），是β-葡萄糖苷酶（β-glucuronidase，GUS）的顯色底物，由一種廣泛使用的報(bào)告基因gusA（uidA）所編碼。GUS水解X-Gluc，生成一種無(wú)色的葡萄糖醛酸和一種肉眼可見(jiàn)的氯-溴靛藍(lán)（chloro-bromoindigo）深藍(lán)色沉淀。利用這一特性，X-Gluc常用來(lái)檢測(cè)植物細(xì)胞和組織中的GUS表達(dá)；另外，X-Gluc還能用來(lái)檢測(cè)大腸桿菌引起的感染狀況；或檢測(cè)食物或水源是否受細(xì)菌污染。

主要應(yīng)用：轉(zhuǎn)基因植物報(bào)告基因GUS活性檢測(cè)，X-gluc用作顯色底物。

普遍應(yīng)用優(yōu)勢(shì)在于：絕大多數(shù)植物細(xì)胞內(nèi)不存在內(nèi)源性的GUS活性，而且GUS基因表達(dá)產(chǎn)物具有檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、靈敏度高，易于定量及定性分析，能夠與其他蛋白質(zhì)基因融合等優(yōu)勢(shì)，因此，GUS基因?yàn)橹参锕こ萄芯恐袘?yīng)用最廣泛的報(bào)告基因（報(bào)道基因）之一。

1. GUS活性檢測(cè)（組織化學(xué)定位法，定性研究）

GUS催化底物X-gluc在酶活性位點(diǎn)生成深藍(lán)色沉淀，為研究外源基因在植物中表達(dá)具體部位研究提供很好的研究手段。且GUS酶和顯色產(chǎn)物非常穩(wěn)定，植物中可以積累。

1.1 GUS染色液制備【作為參考，可按照具體實(shí)驗(yàn)條件來(lái)調(diào)整】

1.2 GUS定性染色步驟

a）于預(yù)冷固定液（4%多聚甲醛溶液，新鮮制備）固定樣本30min，偶爾搖晃或置于低速搖床上固定；

b）使用預(yù)冷的1×磷酸鹽或檸檬酸鹽酸溶液清洗固定樣本30-60min，中間更換幾次清洗液；

c） 真空滲透法將X-Gluc染色液加入待染色樣本【對(duì)于組織培養(yǎng)的擬南芥不需用真空滲透；】黑暗條件室溫或者37°C孵育幾小時(shí)或過(guò)夜，或者明顯的藍(lán)色沉淀出現(xiàn)（不超過(guò)24h）；

d）去離子清洗染色樣本；

e） 對(duì)于綠色樣本，使用70%乙醇脫色直到葉綠體完全去除，然后轉(zhuǎn)移到去離子水內(nèi)清洗；對(duì)于種子或其他樣本，參考文獻(xiàn)An Improved Clearing Method for GUS Assay inArabidopsis Endosperm and Seeds的替代方法；

f） 肉眼或顯微鏡下觀察，白色背景上的藍(lán)色小點(diǎn)即為GUS表達(dá)位點(diǎn)。

2.  GUS活性檢測(cè)（熒光分析法，定量研究）

GUS催化熒光底物MUG 4-甲基傘型酮-beta-D-葡糖苷酸，將其水解為4-MU（4-甲基傘型酮）和β-D-葡萄糖醛酸。4-MU中的羥基解離后在365nm的光激發(fā)下產(chǎn)生455nm的熒光。此時(shí)用熒光分光光度計(jì)測(cè)定得到的是相對(duì)值，因此同時(shí)需要用標(biāo)準(zhǔn)物4-MU進(jìn)行校準(zhǔn)。

熒光定量分析GUS活性有兩種基本方法：

1）在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定GUS酶作用產(chǎn)物的總熒光量，需要設(shè)定空白對(duì)照，以消除內(nèi)源熒光強(qiáng)度；

2）測(cè)定一段時(shí)間內(nèi)GUS的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。在酶反應(yīng)初始階段，酶作用產(chǎn)物與時(shí)間呈線性關(guān)系，而內(nèi)源性熒光物質(zhì)的熒光量與時(shí)間無(wú)線性關(guān)系。由此可計(jì)算GUS酶活力。GUS酶活性通常以μg MU/min/mg蛋白質(zhì)。有時(shí)也可以用樣本的鮮重來(lái)表示。

2.1  檢測(cè)步驟【僅作參考，根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)條件做適當(dāng)調(diào)整】

a）取約100mg愈傷組織或一片新鮮葉盤(pán)于1.5ml離心管內(nèi)，加入100μl萃取緩沖液（extraction buffer）內(nèi)勻漿?？杉尤肷倭可匙踊虿Ａе樘岣哐心バ省?/p>

萃取緩沖液（extraction buffer）配方：50mM磷酸鹽緩沖液（pH 7.0），10mM DTT，1mM Na2EDTA，0.1%十二烷基肌氨酸，0.1% Triton X-100

b）4°C，15,000rpm離心5min。收集上清轉(zhuǎn)移到另一干凈的1.5ml離心管，冰上放置待用。

c） 取50μl上述萃取上清到0.5ml 37°C預(yù)熱的反應(yīng)緩沖液（Assay buffer）；用移液槍吹勻或漩渦混勻。

反應(yīng)緩沖液（Assay Buffer）：稱取17.6mg MUG溶于50ml萃取緩沖液，此時(shí)即為1mM MUG反應(yīng)液。4°C保存，2周穩(wěn)定。

d）在某一時(shí)間段內(nèi)（高GUS活性樣本30min；或低GUS活性1h-過(guò)夜；）吸取100μl溶液到含900μl終止液（Stop Buffer）的1.5ml離心管內(nèi)，做好標(biāo)記。有可能采集3-4個(gè)時(shí)間點(diǎn)和過(guò)夜孵育的時(shí)間點(diǎn)熒光量。【用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)365nm、發(fā)射波長(zhǎng)455nm下，狹縫10nm時(shí)測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)的熒光強(qiáng)度值?！?/p>

e）以熒光強(qiáng)度值對(duì)反應(yīng)時(shí)間作曲線，求出單位時(shí)間的熒光強(qiáng)度變化。用單位時(shí)間的熒光強(qiáng)度變化除以參加反應(yīng)的蛋白量，求出單位質(zhì)量的蛋白單位時(shí)間的熒光強(qiáng)度變化。

基本特性：

1）CAS NO：114162-64-0

2）英文同義名：5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid, cyclohexylammonium salt;X-beta-D- glucuronide CHA salt;X-Gluc CHA Salt; X-glu CHA Salt; X-glcA CHA Salt; BCIG CHA Salt;

3）分子式：C14H13BrClNO7 ? C6H13N

4）分子量：521.79g/mol

5）純度：＞99%（HPLC）

6）外觀：白色至類白色結(jié)晶性粉末

7）溶解性：DMF、甲醇

8）化學(xué)結(jié)構(gòu)式：

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