Porcine Intestinal Organoid Kit 豬小腸類(lèi)器官培養(yǎng)試劑盒

貨號(hào)：K2269-PI

規(guī)格：100ml

500ml

品牌：bioGenous

產(chǎn)品介紹

bioGenous^TMPorcine Intestinal Organoid Kit（豬小腸類(lèi)器官培養(yǎng)試劑盒）是一款用于建立和維持豬小腸干細(xì)胞來(lái)源類(lèi)器官的完全培養(yǎng)基。生長(zhǎng)在該完全培養(yǎng)基中的豬小腸類(lèi)器官主要由腸干細(xì)胞、腸祖細(xì)胞和腸絨毛細(xì)胞、潘氏細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和少量腸內(nèi)分泌細(xì)胞組成，在自我更新能力、組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞類(lèi)型和功能方面，豬小腸類(lèi)器官重現(xiàn)了體內(nèi)小腸上皮的特征，因此是腸道體外研究的理想體外模型。

技術(shù)參數(shù)

產(chǎn)品信息：

豬小腸類(lèi)器官完全培養(yǎng)基的制備

使用無(wú)菌操作技術(shù)配制豬小腸類(lèi)器官完全培養(yǎng)基，以配制10 mL為例，如所需量不同，可相應(yīng)調(diào)整用量。

1.         冰上解凍Porcine Intestinal Organoid Supplement B (50x)和Porcine Intestinal Organoid Supplement C (250x)。

注意：解凍后，建議將Porcine Intestinal Organoid Supplement B (50x)和Porcine Intestinal Organoid Supplement C (250x) 分別分裝后保存取用，避免反復(fù)凍融。

2.         將200 μL Porcine Intestinal Organoid Supplement B (50x)，40 μL Porcine Intestinal Organoid Supplement C (250x) 加至9.76 mL Porcine Intestinal Organoid Basal Medium中，充分混合，配制成10 mL豬小腸類(lèi)器官完全培養(yǎng)基。

注意：配制后的豬小腸類(lèi)器官完全培養(yǎng)基可在2 - 8°C儲(chǔ)存，建議在兩周內(nèi)使用。Porcine Intestinal Organoid Supplement B(50x)內(nèi)含有細(xì)菌及真菌抗生素(50x)。

豬小腸類(lèi)器官原代培養(yǎng)

1.         依據(jù)所在單位批準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理及操作規(guī)范進(jìn)行動(dòng)物組織取材，取材后的組織須在2 - 8℃組織保存液或DPBS中迅速轉(zhuǎn)運(yùn)至潔凈實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行組織處理和干細(xì)胞分離。

2.         準(zhǔn)備若干培養(yǎng)皿，加入4℃預(yù)冷的DPBS備用。

3.         標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)操作分離豬腸組織，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求取總長(zhǎng)度1 - 10 cm的小腸段，置于含DPBS的培養(yǎng)皿中。

4.         于生物安全柜中使用移液管將小腸一端注入DPBS以沖洗腸內(nèi)容物，沖洗后置于新的含DPBS的培養(yǎng)皿中，反復(fù)沖洗數(shù)次至內(nèi)容物完全被沖洗干凈，置于新的含DPBS的培養(yǎng)皿中。

5.         使用手術(shù)剪將腸管剪開(kāi)，腸腔面朝上，一只手持手術(shù)鑷夾住腸組織一端，另一只手持手術(shù)刀片輕輕刮去腸腔表面腸絨毛，待腸絨毛被刮凈后，將腸組織置于新的含DPBS的培養(yǎng)皿中清洗，重復(fù)清洗一次。

6.         將清洗后的小腸組織剪碎至約2 mm長(zhǎng)寬，并轉(zhuǎn)移至5-10 mL含有2 mM EDTA的預(yù)冷DPBS中消化，4℃孵育30min。

7.         消化完成后，將組織碎片轉(zhuǎn)移到新的含DPBS的培養(yǎng)皿中清洗，重復(fù)一次以去除EDTA。

8.         用5 mL移液管在含冷的DPBS的培養(yǎng)皿或50 mL離心管中吹打、重懸組織碎片，使組織反復(fù)穿過(guò)移液管尖以產(chǎn)生機(jī)械剪切力從而使隱窩與基底層分離，取一部分懸液鏡檢，當(dāng)可以看到大量的隱窩樣結(jié)構(gòu)后，停止吹打并將吹打后的組織懸液通過(guò)70μm濾器過(guò)濾。

9.         收集濾液，300×g，4℃離心3 min。

10.     棄上清，使用1 mLDPBS重懸組織沉淀，取20 μL懸液進(jìn)行鏡檢和隱窩計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)完成后吸取包含所需隱窩量的懸液，300×g，4℃離心3 min，棄上清后置于冰上預(yù)冷。

11.     用適量的Matrigel重懸組織沉淀，推薦重懸密度為每25 μL Matrigel懸液包含100 - 500個(gè)隱窩，重懸后置于冰上，重懸時(shí)間不超過(guò)30 s以避免Matrigel過(guò)早凝固。

注意：Matrigel 稀釋比例應(yīng)在70%以上以保證培養(yǎng)過(guò)程中Matrigel的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

12.     將Matrigel和組織細(xì)胞小心均勻混合以防止氣泡產(chǎn)生并將懸液加入24孔板，25μL每孔滴加在孔底中心，避免懸液接觸孔板側(cè)壁。

注意：為防止Matrigel室溫凝固，此步驟應(yīng)盡快完成。

13.     將接種完成后的培養(yǎng)板置于37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育15min左右待Matrigel凝固后取出。

14.     提前配制豬小腸類(lèi)器官完全培養(yǎng)基。

注意：原代或細(xì)胞分選后的類(lèi)器官建立，需要在前2 d的培養(yǎng)體系中加入10 μM的Y27632。

15.     每孔沿孔壁加入500 μL提前預(yù)熱的豬小腸類(lèi)器官完全培養(yǎng)基，再向24孔板最外周孔中每孔加入500 μL無(wú)菌水，置于37℃溫箱、5% CO₂條件下培養(yǎng)。

注意：請(qǐng)沿孔壁緩慢加入，避免破壞已凝固結(jié)構(gòu)。

16.     每 3 d更換一次培養(yǎng)基，更換培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)避免破壞Matrigel。

17.     密切監(jiān)測(cè)類(lèi)器官生長(zhǎng)狀態(tài)，理想情況下應(yīng)在5 - 7 d內(nèi)建成。

豬小腸類(lèi)器官傳代培養(yǎng)

1.         用經(jīng)過(guò)Anti-Adherence Rinsing Kit (E238002)潤(rùn)洗的槍頭吹打刮取類(lèi)器官，并將類(lèi)器官和培養(yǎng)基的懸液轉(zhuǎn)移至經(jīng)過(guò)Anti-Adherence Rinsing Kit潤(rùn)洗的1.5mL EP管中。

2.         用經(jīng)過(guò)Anti-Adherence Rinsing Kit潤(rùn)洗的槍頭用力重懸類(lèi)器官懸浮液，多次吹打使得類(lèi)器官與Matrigel分離。

3.         300×g，4℃離心3 min，棄上清，用經(jīng)過(guò)Anti-Adherence Rinsing Kit潤(rùn)洗的槍頭加入200 μLOrganoid Dissociation Solution（E238001）并充分混勻，37℃條件下消化1 - 3 min，消化結(jié)束后加入1 mL Epithelial Organoid Basal Medium 吹打混勻。

4.         300×g，4℃離心3 min，棄上清，再次加入1 mL Epithelial Organoid Basal Medium 并混勻。

5.         300×g，4℃再次離心3min，棄上清后置于冰上。

6.         用適量的Matrigel重懸類(lèi)器官沉淀，重懸后置于冰上，重懸時(shí)間不超過(guò)30 s以避免Matrigel過(guò)早凝固。

注意：Matrigel 稀釋比例應(yīng)在70%以上以保證培養(yǎng)過(guò)程中Matrigel的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

7.         將Matrigel和類(lèi)器官的混合懸液點(diǎn)入24孔板底部正中央，避免懸液接觸孔板側(cè)壁，每孔30μL左右。

注意：為防止Matrigel室溫凝固，此步驟應(yīng)盡快完成。

8.         將接種完成后的培養(yǎng)板至于37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育15min左右待Matrigel凝固后取出。

9.         配制豬小腸類(lèi)器官完全培養(yǎng)基。

10.     待Matrigel完全凝固后，沿孔壁加入提前預(yù)熱的豬小腸類(lèi)器官完全培養(yǎng)基，24孔板每孔500μL。

11.     將24孔板置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長(zhǎng)出新的類(lèi)器官之后可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。