D-Luciferin, Potassium Salt D-熒光素鉀鹽

 溫馨提示：見我司整理的活體成像研究底物之：Firefly D-Luciferin D-蟲熒光素（Luc基因）產(chǎn)品專題。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

D-熒光素（D-Luciferin）是熒光素酶（Luciferase）的常用底物，普遍用于整個(gè)生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是體內(nèi)活體成像技術(shù)。作用機(jī)制是在ATP和熒光素酶的作用下，D-熒光素（底物）被氧化發(fā)光。當(dāng)熒光素過量時(shí)，產(chǎn)生的光量子數(shù)與熒光素酶的濃度呈正相關(guān)性。將攜帶熒光素酶編碼基因（Luc）的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞后，導(dǎo)入研究動(dòng)物如大小鼠體內(nèi)，之后注入熒光素，通過生物發(fā)光成像技術(shù)（BLI）來檢測(cè)光強(qiáng)度變化，從而實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)疾病發(fā)展?fàn)顟B(tài)或藥物的治療功效等。也可以利用ATP對(duì)此反應(yīng)體系的影響，根據(jù)生物發(fā)光強(qiáng)度的變化來指示能量或生命體征。

D-熒光素也常用于體外研究，包括熒光素酶和ATP水平分析；報(bào)告基因分析；高通量測(cè)序和各種污染檢測(cè)。目前有三種產(chǎn)品形式：D-熒光素（游離酸），D-熒光素鹽（鈉鹽和鉀鹽）。主要差別在于溶解特性：

1）D-熒光素（游離酸）在水以及緩沖體系內(nèi)的溶解性都很弱，除非溶于弱堿如NaOH和KOH溶液。溶于甲醇（10 mg/ml）和DMSO（50 mg/ml）。

2）D-熒光素（鈉鹽）和D-熒光素（鉀鹽）能夠非常容易且快速的溶入水或者緩沖液中，使用方便，溶劑無毒性，特別適合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。配成溶液后的三種產(chǎn)品，在絕大多數(shù)應(yīng)用上都沒有實(shí)質(zhì)性的差別。

3）D-熒光素（鈉鹽）和D-熒光素（鉀鹽）基本上沒有差別，主要是使用習(xí)慣等因素影響。整體來看，鉀鹽的應(yīng)用文獻(xiàn)明顯多于鈉鹽。

基本特性：

1）CAS NO：115144-35-9

2）化學(xué)名：4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt,D-Luciferin firefly, potassium salt

3）分子式：C₁₁H₇N₂O₃S₂K

4）分子量：318.42 g/mol

5）純度：＞99% (HPLC)，分子生物學(xué)級(jí)（超純）

6）外觀：淺黃色至黃色粉末

7）溶解性：溶于水（60 mg/ml）

保存條件: 

-20℃干燥避光儲(chǔ)存，有效期2年。

產(chǎn)品使用：

A．體外生物發(fā)光檢測(cè)

1）儲(chǔ)存液制備

用蒸餾水溶解D-熒光素（鉀鹽），配制成15mg/ml的儲(chǔ)存液（100×），混勻后立即使用或分裝于-20℃或-80℃凍存，避免反復(fù)凍融。建議使用的工作液濃度為150μg/ml（相當(dāng)于468μM）。

2）熒光素酶反應(yīng)緩沖液制備

配方【1×，參考Yuichi Oba, et al., 2003】：100mM Tris-HCl（pH 7.8），5mM MgCl₂，250μM CoA，150μM ATP。具體緩沖液組成可參考其他文獻(xiàn)資料來調(diào)整。按照以上配方制備熒光素酶反應(yīng)緩沖液（2×）。

3）收集細(xì)胞裂解上清（熒光素酶表達(dá)）

根據(jù)需要檢測(cè)的細(xì)胞類型，選擇合適的裂解液進(jìn)行細(xì)胞裂解，離心收集上清后續(xù)檢測(cè)待用。

4）螢火蟲熒光信號(hào)檢測(cè)

【注①】：螢火蟲熒光信號(hào)的檢測(cè)方法大體上取決于冷光測(cè)定儀（luminometer）類型（是手動(dòng)型熒光計(jì)、單管注射型或者酶標(biāo)板讀數(shù)型熒光計(jì)）。根據(jù)特定發(fā)光測(cè)定儀，來考慮注射用量和程序設(shè)置。

【注②】：需設(shè)置不含熒光素酶的孔（用作陰性對(duì)照），以測(cè)定背景熒光。

例：注射式冷光測(cè)定儀（injectible luminometer，單樣或微孔板，200μl終體積）

a）吸取100μl熒光素酶反應(yīng)緩沖液（2×）到一干凈的冷光測(cè)定儀比色皿或96孔板的各孔（最好使用全白平底的96孔板）；

b）吸取50~98μl裂解上清到皿或孔內(nèi)；

c） 如果有需要，用水來補(bǔ)足使得總體積到198μl；

d）設(shè)置程序注射2μl熒光素儲(chǔ)存液（使工作濃度150μg/ml），程序：2~5秒延遲（delay），之后10s測(cè)定。

B．活體成像分析

1）用無菌的PBS（w/o Mg²⁺）或者DPBS（w/o Mg²⁺）配制D-熒光素（鉀鹽）工作液（15mg/ml），0.2μm濾膜過濾除菌?；靹蚝罅⒓词褂没蚍盅b于-20℃或-80℃凍存，避免反復(fù)凍融。一旦使用，放到4℃解凍，保持冰冷且避光。

2）注射量取決于注射方式，具體如下：

3）注射入體內(nèi)10-20 min（待光信號(hào)達(dá)到最強(qiáng)穩(wěn)定平臺(tái)期），再進(jìn)行成像分析。

注：建議對(duì)每只動(dòng)物模型都需要建立熒光素酶動(dòng)力學(xué)曲線，從而確定最高信號(hào)檢測(cè)時(shí)間和信號(hào)平臺(tái)期。

注意事項(xiàng)：

1.      本品要進(jìn)行避光操作和保存。

2.      為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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