活體成像研究底物之：

Firefly D-Luciferin D-蟲熒光素（Luc基因）

（活體成像研究/體外生物發(fā)光研究/轉(zhuǎn)錄水平研究）

基本描述：

D-熒光素（D-Luciferin）是熒光素酶（Luciferase）的常用底物，普遍用于整個(gè)生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是體內(nèi)活體成像技術(shù)。作用機(jī)制是在ATP和熒光素酶的作用下，D-熒光素（底物）被氧化發(fā)光。當(dāng)熒光素過(guò)量時(shí)，產(chǎn)生的光量子數(shù)與熒光素酶的濃度呈正相關(guān)性（見(jiàn)下圖）。將攜帶熒光素酶編碼基因（Luc）的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞后，導(dǎo)入研究動(dòng)物如大小鼠體內(nèi)，之后注入熒光素，通過(guò)生物發(fā)光成像技術(shù)（BLI）來(lái)檢測(cè)光強(qiáng)度變化，從而實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)疾病發(fā)展?fàn)顟B(tài)或藥物的治療功效等。也可以利用ATP對(duì)此反應(yīng)體系的影響，根據(jù)生物發(fā)光強(qiáng)度的變化來(lái)指示能量或生命體征。

基本應(yīng)用：

1）體內(nèi)活體成像In vivo imaging；熒光素酶標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞、干細(xì)胞或傳染疾病通常注射入研究動(dòng)物模型比如大小鼠內(nèi)進(jìn)行研究，從而對(duì)動(dòng)物模型進(jìn)行實(shí)時(shí)和非侵略性的監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)程和/或藥效。

2）體外研究，包括熒光素酶和ATP水平分析；報(bào)告基因分析；高通量測(cè)序和各種污染檢測(cè)。

常見(jiàn)商業(yè)化類型的差異（熒光素鉀，鈉，游離酸）：

目前市場(chǎng)上常見(jiàn)的有三種產(chǎn)品形式，D-熒光素（游離酸），D-熒光素（鈉鹽），和D-熒光素（鉀鹽）。這三種產(chǎn)品主要差別在于溶解特性。

1）D-熒光素（游離酸）在水以及緩沖體系內(nèi)的溶解性都很弱，除非溶于弱堿如NaOH和KOH溶液。溶于甲醇（10 mg/ml）和DMSO（50 mg/ml）。

2）D-熒光素（鈉鹽）和D-熒光素（鉀鹽）能夠非常容易且快速的溶入水或者緩沖液中，使用方便，溶劑無(wú)毒性，特別適合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。配成溶液后的三種產(chǎn)品，在絕大多數(shù)應(yīng)用上都沒(méi)有實(shí)質(zhì)性的差別。

3）D-熒光素（鈉鹽）和D-熒光素（鉀鹽）基本上沒(méi)有差別，主要是使用習(xí)慣等因素影響。整體來(lái)看，鉀鹽的應(yīng)用文獻(xiàn)明顯多于鈉鹽。

使用方法【體內(nèi)成像/腹腔注射】

一．  儲(chǔ)存液制備（Luciferin preparation）

1.1  將D-熒光素鉀鹽（或D-熒光素鈉鹽）凍干粉回至室溫，溶于DPBS（無(wú)鈣/鎂）使其終濃度為15mg/ml。

1.2  用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，條件許可現(xiàn)配現(xiàn)用。若單次實(shí)在用不完，則分裝后置于≤-20℃保存，避免反復(fù)凍融。一旦使用，放到4℃解凍，保持冰冷且避光。

二．動(dòng)力學(xué)曲線建立（Kinetic curve）

由于D-熒光素進(jìn)入體內(nèi)的生物分布非?？焖偾覄?dòng)力學(xué)具組織依賴性，因此，研究人員需正式實(shí)驗(yàn)前確定自身動(dòng)物在D-熒光素注射后的成像采集最佳時(shí)間。通過(guò)建立動(dòng)物模型的熒光素酶動(dòng)力學(xué)曲線來(lái)完成。

D-熒光素給藥的方式有腹腔注射（ip）、靜脈注射（iv）或皮下注射（sc），通常給藥方式為腹腔和靜脈。以下以腹腔注射為例。

2.1 如下腹腔注射（i.p.）D-熒光素。如果給藥前需麻醉小鼠，需要注意此步操作可能稍微延長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)（熒光素酶峰值表達(dá)時(shí)間）。

2.2 a）如果在動(dòng)物保持清醒時(shí)給藥，等待三分鐘，之后按照所選方法麻醉動(dòng)物（氣化或注射麻醉）。b）將麻醉后動(dòng)物置于成像室內(nèi)，給藥后約5min開(kāi)始第一次拍照。

2.3 對(duì)于腹腔注射模型，每5-10min（最長(zhǎng)達(dá)40-60min）拍一次照以建立熒光素酶表達(dá)的動(dòng)力學(xué)曲線?！敬蠖鄶?shù)注射麻醉藥持續(xù)20-30min，要完成一次完整的動(dòng)力學(xué)研究可能需要再給一次麻醉藥物。使用2%異氟烷氣體麻醉健康動(dòng)物能在活體成像系統(tǒng)如IVIS內(nèi)安全放置45min?！?/span>

2.4 根據(jù)模型建立的動(dòng)力學(xué)曲線選擇最佳時(shí)間點(diǎn)采集圖像。【許多模型研究表明腹腔或皮下注射后約10-20min達(dá)到信號(hào)峰值，靜脈注射后約2-5min達(dá)到信號(hào)峰值?！?/span>

三．腹腔注射（i.p.）技術(shù)要點(diǎn)

應(yīng)用示例【生物化學(xué)發(fā)光體內(nèi)成像】：

Fig. 1 Image illustrates the IVIS spectrum imager and a mouse placed inside the camera box.

Fig. 2 Bioluminescence in vivo imaging. A. Representative luciferase time course (every 2 min) imaging of mice bearing subcutaneous tumors injected with luciferin. B. Graph illustrates the bioluminescence saturation of the whole mouse (displayed in A.) obtained

附錄I 各種給藥途徑和模型動(dòng)物的建議位點(diǎn)、針頭大小和注射體積

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