Mouse Colonic Organoid Kit 小鼠結(jié)腸類器官培養(yǎng)試劑盒

貨號：K2204-MC

規(guī)格：100ml

500ml

品牌：bioGenous

產(chǎn)品介紹

bioGenous^TMMouse Colonic Organoid Kit（小鼠結(jié)腸類器官培養(yǎng)試劑盒）是一款用于擴(kuò)增和分化小鼠結(jié)腸類器官的完全培養(yǎng)基。擴(kuò)增時的小鼠結(jié)腸類器官主要由結(jié)腸干細(xì)胞和結(jié)腸祖細(xì)胞組成，分化后的小鼠結(jié)腸類器官由結(jié)腸吸收細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和少量腸內(nèi)分泌細(xì)胞組成。結(jié)腸類器官在自我更新和分化能力、組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞類型和功能方面，重現(xiàn)了體內(nèi)結(jié)腸上皮的特征，因此是小鼠結(jié)腸研究的理想體外模型。

技術(shù)參數(shù)

產(chǎn)品信息：

小鼠結(jié)腸類器官完全培養(yǎng)基的制備

使用無菌操作技術(shù)配制小鼠結(jié)腸類器官的擴(kuò)增或分化培養(yǎng)基。以配制10mL為例配置小鼠結(jié)腸類器官擴(kuò)增或分化培養(yǎng)基，如所需量不同，可相應(yīng)調(diào)整用量。

1.       冰上解凍Mouse Colonic Organoid Supplement B (50x)，Mouse Colonic Organoid Supplement C (250x)和Mouse Colonic Organoid Supplement D (250x)。

2.       注意：各Supplement添加物解凍后，建議分別分裝后保存取用，避免反復(fù)凍融。

3.         小鼠結(jié)腸類器官的擴(kuò)增培養(yǎng)基：將200uL Mouse Colonic Organoid Supplement B (50x)，40μL Mouse Colonic Organoid Supplement C (250x)和40μL Mouse Colonic Organoid Supplement D (250x)加至9.72mL Mouse Colonic Organoid Basal Medium中，充分混合，配制成10mL小鼠結(jié)腸類器官擴(kuò)增培養(yǎng)基。

4.         小鼠結(jié)腸類器官的分化培養(yǎng)基：將200μL Mouse Colonic Organoid Supplement B (50x)，40μL Mouse Colonic Organoid Supplement C (250x)加至9.76mL Mouse Colonic Organoid Basal Medium中，充分混合，配制成10mL小鼠結(jié)腸類器官分化培養(yǎng)基。

5.         注意：配制后的小鼠結(jié)腸類器官擴(kuò)增或分化培養(yǎng)基可在2-8°C儲存10天。此外，Mouse Colonic Organoid Supplement B(50x)內(nèi)含有細(xì)菌及真菌抗生素(50x)。

小鼠結(jié)腸類器官原代培養(yǎng)

6.         依據(jù)所在單位批準(zhǔn)的實驗動物倫理及操作規(guī)范進(jìn)行動物組織取材，取材后的組織須在2 - 8℃組織保存液或DPBS中迅速轉(zhuǎn)運(yùn)至潔凈實驗室進(jìn)行組織處理和干細(xì)胞分離。

7.         準(zhǔn)備若干培養(yǎng)皿，加入4℃預(yù)冷的DPBS備用。

8.         標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)操作分離小鼠結(jié)腸組織，根據(jù)實驗需求取總長度3 - 10 cm的結(jié)腸段，置于含DPBS的培養(yǎng)皿中。

9.         于生物安全柜中使用移液管將結(jié)腸一端注入DPBS以沖洗腸內(nèi)容物，沖洗后置于新的含DPBS的培養(yǎng)皿中，反復(fù)沖洗數(shù)次至內(nèi)容物完全被沖洗干凈，置于新的含DPBS的培養(yǎng)皿中。

10.     使用手術(shù)剪將腸管剪開，腸腔面朝上，一只手持手術(shù)鑷夾住腸組織一端，另一只手持手術(shù)刀片輕輕刮去腸腔表面腸絨毛，待腸絨毛被刮凈后，將腸組織置于新的含DPBS的培養(yǎng)皿中清洗，重復(fù)清洗一次。

11.     將清洗后的結(jié)腸組織剪碎至約2 mm長寬，并轉(zhuǎn)移至5-10 mL含有2 mM EDTA的預(yù)冷DPBS中消化，4℃孵育30min。

12.     消化完成后，將組織碎片轉(zhuǎn)移到新的含DPBS的培養(yǎng)皿中清洗，重復(fù)一次以去除EDTA。

13.     用5 mL移液管在含冷的DPBS的培養(yǎng)皿或50 mL離心管中吹打、重懸組織碎片，使組織反復(fù)穿過移液管尖以產(chǎn)生機(jī)械剪切力從而使隱窩與基底層分離，取一部分懸液鏡檢，當(dāng)可以看到大量的隱窩樣結(jié)構(gòu)后，停止吹打并將吹打后的組織懸液通過70μm濾器過濾。

14.     收集濾液，300×g，4℃離心3 min。

15.     棄上清，使用1 mLDPBS重懸組織沉淀，取20 μL懸液進(jìn)行鏡檢和隱窩計數(shù)，計數(shù)完成后吸取包含所需隱窩量的懸液，300×g，4℃離心3 min，棄上清后置于冰上預(yù)冷。

16.     用適量的Matrigel重懸組織沉淀，推薦重懸密度為每25 μL Matrigel懸液包含50 - 300個隱窩，重懸后置于冰上，重懸時間不超過30 s以避免Matrigel過早凝固。

注意：Matrigel 稀釋比例應(yīng)在70%以上以保證培養(yǎng)過程中Matrigel的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

17.     將Matrigel和組織細(xì)胞小心均勻混合以防止氣泡產(chǎn)生并將懸液加入24孔板，25μL每孔滴加在孔底中心，避免懸液接觸孔板側(cè)壁。

注意：為防止Matrigel室溫凝固，此步驟應(yīng)盡快完成。

18.     將接種完成后的培養(yǎng)板置于37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育15min左右待Matrigel凝固后取出。

19.     提前配制小鼠結(jié)腸類器官擴(kuò)增培養(yǎng)基。

20.     每孔沿孔壁加入500 μL提前預(yù)熱的小鼠結(jié)腸類器官擴(kuò)增培養(yǎng)基，再向24孔板最外周孔中每孔加入500 μL無菌水，置于37℃溫箱、5% CO₂條件下培養(yǎng)。

注意：請沿孔壁緩慢加入，避免破壞已凝固結(jié)構(gòu)。

21.     每 3 d更換一次培養(yǎng)基，更換培養(yǎng)基時應(yīng)避免破壞Matrigel。

22.     密切監(jiān)測類器官生長狀態(tài)，原代小鼠結(jié)腸類器官應(yīng)在5 - 7 d內(nèi)建成。

小鼠結(jié)腸類器官傳代培養(yǎng)和分化

1.         用經(jīng)過Anti-Adherence Rinsing Kit (E238002)潤洗的槍頭吹打刮取類器官，并將類器官和培養(yǎng)基的懸液轉(zhuǎn)移至經(jīng)過Anti-Adherence Rinsing Kit潤洗的1.5mL EP管中。

2.         用經(jīng)過Anti-Adherence Rinsing Kit潤洗的槍頭用力重懸類器官懸浮液，多次吹打使得類器官與Matrigel分離。

3.         300×g，4℃離心3 min，棄上清，用經(jīng)過Anti-Adherence Rinsing Kit潤洗的槍頭加入200 μLOrganoid Dissociation Solution（E238001）并充分混勻，37℃條件下消化1 - 3 min，消化結(jié)束后加入1 mL Epithelial Organoid Basal Medium（B213151）吹打混勻。

4.         300×g，4℃離心3 min，棄上清，再次加入1 mL Epithelial Organoid Basal Medium 并混勻。

5.         300×g，4℃再次離心3min，棄上清后置于冰上。

6.         用適量的Matrigel重懸類器官沉淀，重懸后置于冰上，重懸時間不超過30 s以避免Matrigel過早凝固。

注意：Matrigel 稀釋比例應(yīng)在70%以上以保證培養(yǎng)過程中Matrigel的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

7.         將Matrigel和類器官的混合懸液點入24孔板底部正中央，避免懸液接觸孔板側(cè)壁，每孔30μL左右。

注意：為防止Matrigel室溫凝固，此步驟應(yīng)盡快完成。

8.         將接種完成后的培養(yǎng)板至于37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育15min左右待Matrigel凝固后取出。

9.         配制小鼠結(jié)腸類器官擴(kuò)增培養(yǎng)基。

10.     待Matrigel完全凝固后，沿孔壁加入提前預(yù)熱的小鼠結(jié)腸類器官擴(kuò)增培養(yǎng)基，24孔板每孔500μL。

11.     將24孔板置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待新長出的類器官直徑超過100 μm后可進(jìn)行分化實驗。

12.     分化前需要吸去24孔板培養(yǎng)孔中的小鼠結(jié)腸類器官擴(kuò)增培養(yǎng)基，并加入500μL提前配制的分化培養(yǎng)基，分化通常需要4 d以上時間，分化期間每隔2 d更換一次分化培養(yǎng)基，分化完成后可進(jìn)行后續(xù)實驗。