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SYBR Green qPCR Mix(with Rox)

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GDSBio(東盛)  SYBR Green qPCR Mix
  • GDSBio(東盛)  SYBR Green qPCR Mix

SYBR Green qPCR Mix(with Rox)

貨號(hào):P2091a(1ml), P2092a(1mlx5) ,P2093a(1mlx10)
品牌:東盛
價(jià)格: 400.00~3420.00
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P2091a P2092a P2093a

SYBR? Green qPCR Mix (with ROX)

Cat. #:P2091a,P2092a,P2093a

產(chǎn)品簡(jiǎn)介


SYBR? Green qPCR Mix是2X濃縮的實(shí)時(shí)定量PCR預(yù)混液,使用時(shí)只需加入模板和引物即可進(jìn)行反應(yīng)。采用創(chuàng)新的熱啟動(dòng)機(jī)制可以減少引物二聚體和其他次級(jí)產(chǎn)物對(duì)反應(yīng)的干擾,可以顯著提高定量PCR的特異性、擴(kuò)增效率,得到更廣的可定量擴(kuò)增區(qū)域。采用了新的增強(qiáng)劑,對(duì)各種目的片段 PCR 效率的波動(dòng)可控制在最小范圍內(nèi),反復(fù)凍融對(duì)擴(kuò)增性能影響極小。本品配有進(jìn)口參比染料ROX,適用于需要ROX校正的定量PCR機(jī)型,如ABI等。

產(chǎn)品組成


Component

P2091a

P2092a

P2093a

2X SYBR? Green qPCR Mixa

1 ml

1 ml × 5

1 ml × 10

100X ROX Reference Dye*

40 μl

200 μl

400 μl

超純水

1 ml

1 ml × 5

-

a 包含SYBR? Green I,Hotstart Taq DNA聚合酶,Aptamer,dNTP及反應(yīng)緩沖液等。

* 所配ROX含量為最終反應(yīng)體系的2%,請(qǐng)根據(jù)需要調(diào)整用量。

保存條件

SYBR? Green qPCR Mix -20℃避光保存2年,4℃避光可短期保存。ROX Reference Dye -20℃避光可長(zhǎng)期保存。

質(zhì)量控制


純度檢測(cè):經(jīng)質(zhì)量檢測(cè),產(chǎn)品不含脫氧核糖核酸內(nèi)切酶、脫氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。

功能檢測(cè):經(jīng)不同來源的模板和引物檢測(cè),產(chǎn)品具有優(yōu)秀的特異性、靈敏性及可重復(fù)性等。

應(yīng)用舉例

1. 配制反應(yīng)體系

Component

Volume

Final   concentration

DNA template[1]

0.5-2 μl

1-4 μl

Variable

Forward primer (10 μM)[2]

0.2 μl

0.4 μl

0.2 μM

Reverse primer (10 μM)

0.2 μl

0.4 μl

0.2 μM

2X SYBR? Green qPCR Mix[3]

5 μl

10 μl

1X

100X ROX Reference Dye[4]

Variable

Variable

Variable

ddH2O

Variable

Variable

-

Total volume[5]

10 μl

20 μl

-

[1] DNA模板建議用量(10-20 μl體系):1-10 ng cDNA,或10-100 ng gDNA。加樣體積不宜過小,以免造成較大的誤差,但是cDNA的量不宜超過總體積的1/10。因此模板建議濃度(加樣前):cDNA 1-10 ng/μl,gDNA 10-100 ng/μl。

[2] 引物終濃度建議范圍:0.2-0.6 μM。特異性差時(shí)可降低濃度,效率低時(shí)可提高濃度。

[3] 如果熔解曲線出現(xiàn)雜峰,可以減少M(fèi)ix用量至8 μl(20 μl體系);如果對(duì)痕量模板的檢出率較低,可以增加Mix用量至12 μl(20 μl體系)。

[4] 對(duì)于某些固定型號(hào)的儀器,需要添加ROX才能精確測(cè)定Ct值。ROX會(huì)給熔解曲線分析造成一定的背景干擾。因此,為了避免ROX的雜峰背景干擾,在應(yīng)用軟件的“Passive Reference Dye”中不要選擇檢測(cè)ROX熒光值選項(xiàng),然后再進(jìn)行數(shù)據(jù)的收集與分析。由于ROX的使用體積較小,建議將ROX提前與qPCR Mix混勻使用。ROX用量參照具體儀器說明,下表僅供參考。

Instruments

ROX (100X)

ABI PRISM 7000/   PRISM 7700/ 7300/ 7900HT/ Step One/ Step One Plus/ GeneAmp 5700

1-2% (High ROX)

ABI 7500/ 7500   Fast/ ViiA 7/ QuantStudio 6/7/12K Flex; Agilent Stratagene Mx3000P/ Mx3005P/   Mx4000

0.2% (Low ROX)

Bio-Rad CFX96/   CFX384/ iQ/ iQ5; MJ Research Opticon 2/ Chromo 4; Roche LightCycler 480/ 96;   Corbett Rotor Gene G/ Q/ 3000/ 6000; Thermo PikoReal 96; Eppendorf   MasterCycler ep realplex; Cepheid Smart Cycler

No ROX

[5] 建議總體積不小于10 μl,以免造成較大的加樣誤差。具體體積范圍參考儀器說明。

2. 設(shè)定反應(yīng)程序進(jìn)行qPCR反應(yīng)

注:本品含有熱啟動(dòng)酶,在60℃時(shí)會(huì)抑制酶活性,因此不建議使用兩步法,推薦使用經(jīng)典三步法或極速三步法。

經(jīng)典三步法程序示例如下:

Stage

Temperature

Time

Cycle

Initial denaturation

94℃

3 min

1

Denaturation

94℃

15 sec

40

Annealing

55-65℃[1]

15 sec

Extension

72℃

20 sec

Dissociation/Melting curve analysis(optional)[3]

本品可用極速三步法快速完成反應(yīng),程序示例如下:

Stage

Temperature

Time

Cycle

Initial denaturation

94℃

3 min

1

Denaturation

94℃

5 sec

40

Annealing

55-65℃[1]

5 sec

Extension

72℃

5-10 sec[2]

Dissociation/Melting curve analysis(optional)[3]

[1] 最適退火溫度需要摸索。退火溫度一般設(shè)定為所用引物的Tm-5℃,若低于55℃,則以Tm值為退火溫度,一般不低于55℃。

[2] 150 bp以內(nèi)的擴(kuò)增子可設(shè)置為5 sec;150-300 bp的擴(kuò)增子可設(shè)置為10 sec;300 bp以上的擴(kuò)增子可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間。

[3] 不同儀器熔解曲線采集程序不同,一般按儀器默認(rèn)熔解曲線采集程序即可??稍谘由欤ㄈ椒ǎ┗蛲嘶鹧由欤▋刹椒ǎ╇A段采集信號(hào),也可在反應(yīng)結(jié)束后72 hrs之內(nèi)采集(避光低溫保存)。

3. 分析結(jié)果

觀察擴(kuò)增曲線;調(diào)整基線,計(jì)算Ct值;觀察熔解曲線檢測(cè)特異性;進(jìn)行相對(duì)或絕對(duì)定量。

注意事項(xiàng)

? 使用前Mix需要完全解凍,充分混勻。盡量避免多次反復(fù)凍融。短期使用可避光保存于4℃。

? 將(n+x)份反應(yīng)液混勻后再分注到n個(gè)單管中,可降低加樣誤差。(n為重復(fù)次數(shù),x為損耗量,一般為n的1/10)

? ABI的定量?jī)x器大部分需要ROX校正管間差異,Bio-Rad的定量?jī)x器不需要ROX校正。具體儀器請(qǐng)參照其使用說明。

? 輕輕混勻反應(yīng)液,避免產(chǎn)生氣泡,氣泡會(huì)干擾熒光檢測(cè)??伤矔r(shí)離心去除氣泡。

? 引物的特異性、用量以及退火溫度是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要因素。務(wù)必設(shè)計(jì)特異性好的引物,隨實(shí)驗(yàn)結(jié)果適當(dāng)調(diào)整引物用量(0.05-0.9 μM)——特異性較差時(shí)減少引物用量,或以3℃為增量提高退火溫度,擴(kuò)增效率較低時(shí)增加引物用量。

? DNA模板的量應(yīng)小于500 ng/反應(yīng),過高的模板量會(huì)引起非特異性擴(kuò)增。應(yīng)根據(jù)模板類型與基因表達(dá)量適當(dāng)調(diào)整用量。

? 熔解曲線的采集不是必須的,初次使用的引物建議進(jìn)行熔解曲線采集。熔解曲線可以看出產(chǎn)物的特異性。產(chǎn)物特異性不好的原因有:引物特異性低;退火溫度設(shè)置偏低;引物/模板濃度偏高;等。同時(shí),建議通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物的特異性。


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