HS Probe qPCR Mix with UDG

Cat. #：P2301，P2302，P2303，P2304，P2305

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

HS Probe qPCR Mix with UDG是用于探針法實(shí)時(shí)定量PCR的2×濃縮預(yù)混液，使用時(shí)只需加入模板、引物和探針即可進(jìn)行反應(yīng)。本品含有類抗體技術(shù)修飾的熱啟動(dòng)酶Hotstart Taq DNA聚合酶，配合東盛特制的Real Time PCR Buffer，不僅有效抑制引物二聚體和其他非特異性擴(kuò)增，而且能夠提高擴(kuò)增效率，可以進(jìn)行高靈敏度高特異性的PCR反應(yīng)。該試劑引入了 dUTP/UDG 防污染系統(tǒng)，可以在PCR反應(yīng)前清除含dUTP的PCR產(chǎn)物，有效避免因擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染對(duì)定量的影響。本品在寬廣的定量域內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，對(duì)靶基因定量準(zhǔn)確、可信度高，重復(fù)性好。本品可搭配TaqMan等各類熒光探針使用，與常見定量PCR儀完美兼容，如ABI、Roche、Bio-Rad等。

產(chǎn)品組成

a 包含Hotstart Taq DNA聚合酶，dNTP/dUTP Mix，UDG（Uracil-DNA Glycosylase，尿嘧啶DNA糖基化酶）及反應(yīng)緩沖液等。

保存條件

-20℃保存2年，4℃可短期保存。

質(zhì)量控制

純度檢測(cè)：經(jīng)質(zhì)量檢測(cè)，產(chǎn)品不含脫氧核糖核酸內(nèi)切酶、脫氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。

功能檢測(cè)：經(jīng)不同來源的模板和引物檢測(cè)，產(chǎn)品具有優(yōu)秀的特異性、靈敏性及可重復(fù)性等。

應(yīng)用舉例

1. 配制反應(yīng)體系

請(qǐng)于冰上配制以下反應(yīng)體系：

[1] DNA模板建議用量（20 μl體系）：1-10 ng cDNA，或10-100 ng gDNA。加樣體積不宜過小，以免造成較大的誤差，但未稀釋的cDNA不宜超過總體積的1/10。因此模板建議濃度（加樣前）：cDNA 1-10 ng/μl，gDNA 10-100 ng/μl。

[2] 引物終濃度建議范圍：0.1-1.0 μM, 通常引物終濃度為0.2 μM效果較好。

[3] 使用探針的濃度與Real Time PCR擴(kuò)增儀、探針種類和熒光標(biāo)記物種類有關(guān)，使用時(shí)請(qǐng)參照相關(guān)說明。通常探針終濃度在0.1-0.5 μM之間。

[4] 建議總體積不小于10 μl，以免造成較大的加樣誤差。具體體積范圍參考儀器說明。

注意：對(duì)于某些固定型號(hào)的儀器，需要添加ROX才能精確測(cè)定Ct值。由于ROX的使用體積較小，建議將ROX提前與qPCR Mix混勻使用。ROX用量參照具體儀器說明，下表僅供參考。

2. 設(shè)定反應(yīng)程序進(jìn)行qPCR反應(yīng)

兩步法程序示例如下：

[1] 儀器在此階段進(jìn)行信號(hào)采集。請(qǐng)根據(jù)儀器類型設(shè)置反應(yīng)時(shí)間。如需優(yōu)化溫度，建議在55-65℃范圍內(nèi)調(diào)整。

若反應(yīng)效果不佳，建議采用三步法擴(kuò)增程序。

經(jīng)典三步法程序示例如下：

[1] 儀器在此階段進(jìn)行信號(hào)采集。常用退火溫度在55-65℃之間。退火溫度一般設(shè)定為所用引物的Tm-5℃，若低于55℃，則以Tm值為退火溫度，一般不低于55℃。請(qǐng)根據(jù)儀器類型設(shè)置反應(yīng)時(shí)間。 

3. 分析結(jié)果

觀察擴(kuò)增曲線；調(diào)整基線，計(jì)算Ct值；進(jìn)行相對(duì)或絕對(duì)定量。

注意事項(xiàng)

1 使用前Mix需要完全解凍，充分混勻。盡量避免多次反復(fù)凍融。短期使用可保存于4℃。

2 將（n+x）份反應(yīng)液混勻后再分注到n個(gè)單管中，可降低加樣誤差。（n為重復(fù)次數(shù)，x為損耗量，一般為n的1/10）

3 ABI的定量?jī)x器大部分需要ROX校正管間差異，Bio-Rad的定量?jī)x器不需要ROX校正。具體儀器請(qǐng)參照其使用說明。

4 輕輕混勻反應(yīng)液，避免產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)干擾熒光檢測(cè)?？伤矔r(shí)離心去除氣泡。

5 引物的特異性、用量以及退火溫度是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要因素。務(wù)必設(shè)計(jì)特異性好的引物，隨實(shí)驗(yàn)結(jié)果適當(dāng)調(diào)整引物用量（0.1 μM-1.0 μM）——特異性較差時(shí)減少引物用量，或以3℃為增量提高退火溫度，擴(kuò)增效率較低時(shí)增加引物用量。

6 DNA模板的量應(yīng)小于500 ng/反應(yīng)，過高的模板量會(huì)引起非特異性擴(kuò)增。應(yīng)根據(jù)模板類型與基因表達(dá)量適當(dāng)調(diào)整用量。

7 各類探針應(yīng)參照相應(yīng)的指南進(jìn)行設(shè)計(jì)，并根據(jù)所用擴(kuò)增儀類型、探針種類和熒光標(biāo)記物種類等調(diào)整用量。