HS Probe qPCR Mix with UDG

Cat. #：P2301，P2302，P2303，P2304，P2305

產(chǎn)品簡介

HS Probe qPCR Mix with UDG是用于探針法實時定量PCR的2×濃縮預混液，使用時只需加入模板、引物和探針即可進行反應。本品含有類抗體技術修飾的熱啟動酶Hotstart Taq DNA聚合酶，配合東盛特制的Real Time PCR Buffer，不僅有效抑制引物二聚體和其他非特異性擴增，而且能夠提高擴增效率，可以進行高靈敏度高特異性的PCR反應。該試劑引入了 dUTP/UDG 防污染系統(tǒng)，可以在PCR反應前清除含dUTP的PCR產(chǎn)物，有效避免因擴增產(chǎn)物的交叉污染對定量的影響。本品在寬廣的定量域內(nèi)具有良好的線性關系，對靶基因定量準確、可信度高，重復性好。本品可搭配TaqMan等各類熒光探針使用，與常見定量PCR儀完美兼容，如ABI、Roche、Bio-Rad等。

產(chǎn)品組成

a 包含Hotstart Taq DNA聚合酶，dNTP/dUTP Mix，UDG（Uracil-DNA Glycosylase，尿嘧啶DNA糖基化酶）及反應緩沖液等。

保存條件

-20℃保存2年，4℃可短期保存。

質量控制

純度檢測：經(jīng)質量檢測，產(chǎn)品不含脫氧核糖核酸內(nèi)切酶、脫氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。

功能檢測：經(jīng)不同來源的模板和引物檢測，產(chǎn)品具有優(yōu)秀的特異性、靈敏性及可重復性等。

應用舉例

1. 配制反應體系

請于冰上配制以下反應體系：

[1] DNA模板建議用量（20 μl體系）：1-10 ng cDNA，或10-100 ng gDNA。加樣體積不宜過小，以免造成較大的誤差，但未稀釋的cDNA不宜超過總體積的1/10。因此模板建議濃度（加樣前）：cDNA 1-10 ng/μl，gDNA 10-100 ng/μl。

[2] 引物終濃度建議范圍：0.1-1.0 μM, 通常引物終濃度為0.2 μM效果較好。

[3] 使用探針的濃度與Real Time PCR擴增儀、探針種類和熒光標記物種類有關，使用時請參照相關說明。通常探針終濃度在0.1-0.5 μM之間。

[4] 建議總體積不小于10 μl，以免造成較大的加樣誤差。具體體積范圍參考儀器說明。

注意：對于某些固定型號的儀器，需要添加ROX才能精確測定Ct值。由于ROX的使用體積較小，建議將ROX提前與qPCR Mix混勻使用。ROX用量參照具體儀器說明，下表僅供參考。

2. 設定反應程序進行qPCR反應

兩步法程序示例如下：

[1] 儀器在此階段進行信號采集。請根據(jù)儀器類型設置反應時間。如需優(yōu)化溫度，建議在55-65℃范圍內(nèi)調(diào)整。

若反應效果不佳，建議采用三步法擴增程序。

經(jīng)典三步法程序示例如下：

[1] 儀器在此階段進行信號采集。常用退火溫度在55-65℃之間。退火溫度一般設定為所用引物的Tm-5℃，若低于55℃，則以Tm值為退火溫度，一般不低于55℃。請根據(jù)儀器類型設置反應時間。 

3. 分析結果

觀察擴增曲線；調(diào)整基線，計算Ct值；進行相對或絕對定量。

注意事項

1 使用前Mix需要完全解凍，充分混勻。盡量避免多次反復凍融。短期使用可保存于4℃。

2 將（n+x）份反應液混勻后再分注到n個單管中，可降低加樣誤差。（n為重復次數(shù)，x為損耗量，一般為n的1/10）

3 ABI的定量儀器大部分需要ROX校正管間差異，Bio-Rad的定量儀器不需要ROX校正。具體儀器請參照其使用說明。

4 輕輕混勻反應液，避免產(chǎn)生氣泡，氣泡會干擾熒光檢測?？伤矔r離心去除氣泡。

5 引物的特異性、用量以及退火溫度是影響實驗結果的重要因素。務必設計特異性好的引物，隨實驗結果適當調(diào)整引物用量（0.1 μM-1.0 μM）——特異性較差時減少引物用量，或以3℃為增量提高退火溫度，擴增效率較低時增加引物用量。

6 DNA模板的量應小于500 ng/反應，過高的模板量會引起非特異性擴增。應根據(jù)模板類型與基因表達量適當調(diào)整用量。

7 各類探針應參照相應的指南進行設計，并根據(jù)所用擴增儀類型、探針種類和熒光標記物種類等調(diào)整用量。