總超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒（WST-8 法）

Total Superoxide Dismutase Assay Kit with WST-8
 

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

總SOD活性檢測(cè)試劑盒（WST-8法）利用WST-8顯色反應(yīng)，通過(guò)比色法精準(zhǔn)測(cè)定細(xì)胞、組織及其他樣本中超氧化物歧化酶（SOD）的活力，靈敏度高達(dá)0.5U/mL。

SOD是生物體內(nèi)關(guān)鍵的抗氧化酶，可催化超氧陰離子（O??）歧化為過(guò)氧化氫（H?O?）和氧氣（O?）。反應(yīng)體系中，黃嘌呤氧化酶（XO）產(chǎn)生的超氧陰離子與WST-8生成水溶性甲臜染料；SOD通過(guò)清除超氧陰離子抑制該顯色反應(yīng)，其活力與甲臜產(chǎn)量呈負(fù)相關(guān)，據(jù)此計(jì)算SOD活性。

本試劑盒特別引入過(guò)氧化氫酶，可消除樣本中內(nèi)源性過(guò)氧化氫的干擾（即使H?O?濃度高達(dá)0.1mM，結(jié)果仍不受影響），適用于細(xì)胞/組織勻漿上清、全血、紅細(xì)胞裂解液及血清等多種生物樣本。

保存條件: 

-20℃避光保存（一年有效）

產(chǎn)品組成：

產(chǎn)品使用：

1.      樣品準(zhǔn)備：

a)      細(xì)胞樣品：

對(duì)于貼壁細(xì)胞：吸凈培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS或生理鹽水洗滌一遍，按照每1×10⁶的細(xì)胞加入100-200ul的比例加入SOD樣品制備液，適當(dāng)吹打以充分裂解細(xì)胞；對(duì)于懸浮細(xì)胞：600g離心5min收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS或生理鹽水洗滌一遍，按照每1×10⁶的細(xì)胞加入100-200μl的比例加入SOD樣品制備液，適當(dāng)吹打，以充分裂解細(xì)胞。4℃約12,000g離心3-5min，取上清作為待測(cè)樣品。

b)     組織樣品：

將動(dòng)物用生理鹽水（含0.16mg/ml肝素鈉）灌流清除血液后獲取組織樣品。取適量的組織樣品，加入預(yù)冷的PBS冰浴勻漿。隨后勻漿液12000g，4℃離心3-5min，取上清液作為待測(cè)樣品。

c)      血漿/紅細(xì)胞：

用抗凝管收集血液，顛倒混勻。600g，4℃離心10min，移取上清至1ml離心管中，適量生理鹽水稀釋后即可。紅細(xì)胞樣品可以參考懸浮細(xì)胞樣品的制備方法。

d)     測(cè)定蛋白濃度（建議BCA法）：通常10-20μg蛋白的細(xì)胞或組織勻漿液樣品中的SOD平均活力約1個(gè)活力單位左右（不同細(xì)胞和組織的差異會(huì)比較大，該活力范圍僅作參考）。每種樣品準(zhǔn)備20-100μg蛋白量通常已經(jīng)足夠用于后續(xù)檢測(cè)。

e)      根據(jù)蛋白濃度和預(yù)計(jì)的蛋白使用量，用本試劑盒提供的SOD檢測(cè)緩沖液適當(dāng)稀釋樣品。準(zhǔn)備好的樣品如果當(dāng)天測(cè)定，可以冰浴保存；如果當(dāng)天不能完成測(cè)定，可以-70℃凍存，但建議盡量當(dāng)天完成測(cè)定。

2.      試劑準(zhǔn)備：

a)      WST-8/酶工作液配制（每孔160μl）：

151μl SOD檢測(cè)緩沖液+8μl WST-8+1μl 酶溶液（需先離心混勻）

根據(jù)待檢測(cè)樣品（包括標(biāo)準(zhǔn)品）的數(shù)量，配置適量的 WST-8/酶工作液：

注意：配制好的 WST-8/酶工作液 4℃或冰浴保存，可以在當(dāng)天使用，但建議盡量現(xiàn)配現(xiàn)用。由于酶溶液的用量較少且易沉降，必須注意在使用前先輕輕離心一下，然后適當(dāng)混勻后再使用。

b. 反應(yīng)啟動(dòng)工作液：

1μl 反應(yīng)啟動(dòng)液（40×） + 39μl SOD檢測(cè)緩沖液

根據(jù)待檢測(cè)樣品(包括標(biāo)準(zhǔn)品)的數(shù)量，配制適量的反應(yīng)啟動(dòng)工作液。配制好的反應(yīng)啟動(dòng)工作液 4℃或冰浴保存，可以在當(dāng)天使用，但建議盡量現(xiàn)配現(xiàn)用。

c. （可選）SOD標(biāo)準(zhǔn)品：

需自備SOD標(biāo)準(zhǔn)品，用本試劑盒提供的SOD樣品制備液（當(dāng)樣品用試劑盒提供的SOD樣品制備液制備時(shí)）或SOD檢測(cè)緩沖液（當(dāng)樣品為血液等無(wú)需處理的樣品時(shí)）將SOD標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至如下系列濃度：200U/ml，100U/ml，50U/ml，20U/ml，10U/ml，5U/ml，2U/ml。在隨后的檢測(cè)中可以各取20μL參考樣品進(jìn)行檢測(cè)。

注：為避免稀釋后SOD酶活性的下降，SOD標(biāo)準(zhǔn)品宜現(xiàn)稀釋現(xiàn)使用；本試劑盒對(duì)于SOD的檢測(cè)并不需要SOD作為標(biāo)準(zhǔn)品，但可以使用SOD標(biāo)準(zhǔn)品作為陽(yáng)性對(duì)照或作為對(duì)SOD活性定量的參考。

3.      樣品檢測(cè)：

a)     參考下表使用 96 孔板設(shè)置樣品孔和各種空白對(duì)照孔。并按下表依次加入待測(cè)樣品和其它各種溶液。加入反應(yīng)啟動(dòng)工作液后充分混勻。注意：加入反應(yīng)啟動(dòng)工作液后反應(yīng)即會(huì)開(kāi)始，可以在低溫操作或用排槍操作以減小各孔間因加入反應(yīng)啟動(dòng)工作液的時(shí)間先后差異而導(dǎo)致的誤差。

*如果樣品有顏色或含有抗氧化物質(zhì)，則需設(shè)置空白對(duì)照3；如果樣品沒(méi)有顏色并且也不含有抗氧化物則無(wú)需設(shè)置空白對(duì)照3。

b)     37℃孵育30分鐘。注：孵育25至35分鐘檢測(cè)出來(lái)的SOD活力無(wú)顯著差異，但為保證檢測(cè)結(jié)果的一致性，推薦孵育30分鐘。

c)      在450nm測(cè)定吸光度。如無(wú)450nm濾光片，可以使用420-480nm的濾光片。也可以選擇設(shè)定600nm（或600nm以上，如650nm）作為參比波長(zhǎng)，450nm吸光度的讀數(shù)扣除參比波長(zhǎng)的吸光度讀數(shù)即可作為實(shí)測(cè)讀數(shù)。

4.      結(jié)果計(jì)算：

a)      抑制百分率：

參考如下計(jì)算公式計(jì)算抑制百分率

有空白對(duì)照3：

抑制百分率 = [(A_{空白對(duì)照1} - A_{空白對(duì)照2}) - (A_樣品 - A_{空白對(duì)照3})] / (A_{空白對(duì)照1} - A_{空白對(duì)照2}) × 100%

無(wú)空白對(duì)照3：

抑制百分率 = (A_{空白對(duì)照1} - A_樣品) / (A_{空白對(duì)照1} - A_{空白對(duì)照2}) × 100%

如果計(jì)算出來(lái)的抑制百分率小于30%或大于70%，則通常需要把該樣品重新測(cè)定。盡量使樣品的抑制百分率在30-70%范圍內(nèi)。如果測(cè)定出來(lái)的抑制百分率偏高，則需適當(dāng)稀釋樣品；如果測(cè)定出來(lái)的抑制百分率偏低，則需重新準(zhǔn)備濃度較高的待測(cè)樣品。

b)     酶活力單位定義：

在上述黃嘌呤氧化酶偶聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為50%時(shí)，反應(yīng)體系中的SOD酶活力定義為一個(gè)酶活力單位(unit)。注意：SOD的活力單位的定義方式有很多種，不同的活力單位需根據(jù)其定義的不同進(jìn)行適當(dāng)換算。

c)      酶活力計(jì)算：

SOD活力（units）=抑制百分率/(1-抑制百分率)

例如當(dāng)抑制百分率為50%時(shí)，待測(cè)樣品中SOD酶活力單位＝50%/(1－50%)＝1unit；當(dāng)抑制百分率為60%時(shí)，待測(cè)樣品中SOD酶活力單位＝60%/(1－60%)＝1.5units。

d)     單位換算：

根據(jù)樣品的類型，細(xì)胞/組織的勻漿液/紅細(xì)胞抽提液，可以根據(jù)樣品的蛋白濃度和稀釋倍數(shù)，將SOD活力單位換算為U/g或U/mg蛋白。如果樣品為紅細(xì)胞抽提液，可以根據(jù)血紅蛋白含量，可換算為U/g血紅蛋白或U/mg血紅蛋白。

5.      可選方案：

a)     標(biāo)準(zhǔn)曲線法：可以先使用本試劑盒繪制 SOD 標(biāo)準(zhǔn)品的抑制百分率曲線，然后根據(jù)樣品檢測(cè)到的抑制百分率對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品的抑制百分率曲線計(jì)算出樣品中的SOD酶活力單位。本方案僅供參考，使用本試劑盒時(shí)不必使用本方案進(jìn)行檢測(cè)和計(jì)算。此外，本方案需確保標(biāo)準(zhǔn)品的酶活力數(shù)據(jù)可靠，不會(huì)因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)品的保存問(wèn)題而導(dǎo)致實(shí)際酶活力下降。

b)     動(dòng)力學(xué)法：如果條件許可，使用本試劑盒時(shí)也可以使用動(dòng)力學(xué)方法檢測(cè)SOD的酶活力。通常在步驟3(a)后可以在37℃孵育同時(shí)在450nm連續(xù)測(cè)定吸光度30分鐘。根據(jù)30分鐘內(nèi)的吸光度變化的斜率（K）計(jì)算出抑制百分率：

抑制百分率＝[(K_{空白對(duì)照1}－K_{空白對(duì)照2})－(K_樣品－K_{空白對(duì)照3})]/(K_{空白對(duì)照1}－K_{空白對(duì)照2})×100%

其余的計(jì)算方法同上述非動(dòng)力學(xué)的計(jì)算方法。動(dòng)力學(xué)方法的檢測(cè)和計(jì)算更加精確一些，但檢測(cè)起來(lái)相對(duì)要麻煩一些。使用本試劑盒通常使用非動(dòng)力學(xué)方法即可。

注意事項(xiàng)：

1.      待測(cè)樣品可-70°C保存1個(gè)月，需注意反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致 SOD 部分失活。

2.      樣品制備液中不可含Triton X-100等去垢劑。

3.      抗氧化物會(huì)對(duì)本試劑盒的檢測(cè)產(chǎn)生干擾，例如 0.1mM ascorbic acid，5mM GSH 都會(huì)使測(cè)定出來(lái)的吸光度顯著升高。所以需要設(shè)置使用說(shuō)明中的空白對(duì)照3來(lái)消除樣品中的抗氧化物的干擾。

4.      標(biāo)準(zhǔn)品稀釋時(shí)所用的稀釋液應(yīng)盡量與樣品一致。樣品用試劑盒提供的SOD樣品制備液制備時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品也建議使用SOD樣品制備液進(jìn)行稀釋；當(dāng)樣品為血液等無(wú)需處理的樣品時(shí)，建議使用試劑盒提供的SOD檢測(cè)緩沖液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。

5.      酶溶液需離心混勻，避免分層。

6.      建議每樣品做復(fù)孔，提高準(zhǔn)確性。

7.      為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。