RiboGreen RNA檢測(cè)試劑

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

RiboGreen是一種超靈敏的熒光核酸染料，用于溶液內(nèi)RNA的定量檢測(cè)。在大量分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)微量RNA的檢測(cè)和定量特別重要，這些過(guò)程包括：體外轉(zhuǎn)錄RNA產(chǎn)量的測(cè)定，以及在進(jìn)行Northern Blot、S1核酸酶實(shí)驗(yàn)、RNase保護(hù)實(shí)驗(yàn)、cDNA文庫(kù)制備、逆轉(zhuǎn)錄PCR和差異顯示PCR前對(duì)RNA濃度的測(cè)定。

核酸濃度測(cè)定最常見(jiàn)的方法是測(cè)量260nm波長(zhǎng)處的吸光值（A260），然而，基于吸光值檢測(cè)法主要的缺點(diǎn)在于蛋白和游離核苷酸對(duì)光信號(hào)具有較大的干擾；以及檢測(cè)靈敏度較低（A260=0.1相當(dāng)于溶液中4μg/mL的RNA）；而應(yīng)用靈敏的熒光核酸染料能避免很多由于這些因素引起的問(wèn)題。

RiboGreen能定量濃度低至1ng/mL的RNA，通過(guò)熒光酶標(biāo)儀、標(biāo)準(zhǔn)的熒光光度計(jì)或?yàn)V光熒光計(jì)來(lái)測(cè)量。此探針與RNA結(jié)合后的最大激發(fā)波長(zhǎng)~500nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)~525nm。用熒光酶標(biāo)儀讀數(shù)，200μL的反應(yīng)體系可檢測(cè)低至200pg RNA，這一靈敏度比基于溴化乙錠的熒光分析法高200倍，比基于紫外吸收峰的分析法高1000倍。使用兩個(gè)染料濃度，RiboGreen可測(cè)量的RNA濃度線性范圍可達(dá)3個(gè)數(shù)量級(jí)，從1ng/mL到1μg/mL RNA（見(jiàn)Fig 1）。高寬度實(shí)驗(yàn)（High-range assay）能定量20ng/mL-500ng/mL的RNA，低寬度實(shí)驗(yàn)（Low-range assay）能定量1ng/mL-50ng/mL的RNA，即使體系內(nèi)存在核酸制備物中常見(jiàn)的幾種雜質(zhì)（包括：核苷酸、鹽類、尿素、乙醇、氯仿、表面活性劑、蛋白和瓊脂糖），也能維持這一線性關(guān)系。另外，RiboGreen也會(huì)結(jié)合DNA，先用DNase預(yù)處理混合樣品，再用RiboGreen進(jìn)行RNA選擇性的定量分析。

我司可根據(jù)用戶需求提供多種規(guī)格的RiboGreen RNA檢測(cè)試劑（RiboGreen RNA Reagent），本品以溶于DMSO的母液形式提供，濃度為200×（High-range assay），濃度為2000×（Low-range assay）。

若按照2ml反應(yīng)體系來(lái)計(jì)算（比色皿），10×100 μL規(guī)格可做200次反應(yīng)（High-rangeassay），10×100 μL規(guī)格可做2000次反應(yīng)（Low-range assay）。

Fig. 用RiboGreen RNA試劑測(cè)量RNA標(biāo)準(zhǔn)獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線：High-range assay (A)和Low-range assay(B)。

保存條件: 

2-6℃避光保存，亦可置于-20℃避光保存。至少1年有效。

需自備材料：

1）無(wú)核酸酶水

2）20× TE緩沖液（RNase-free）

3）RNA Standard

4）【可選】熒光比色皿以及熒光光度計(jì)

5）【可選】全黑96孔板以及熒光酶標(biāo)儀

反應(yīng)緩沖液準(zhǔn)備：

TE buffer（10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5）用來(lái)稀釋RiboGreen試劑和RNA樣品，必須保證TE buffer沒(méi)有受到核酸及核酸酶的污染。在處理和準(zhǔn)備各種材料及試劑時(shí)應(yīng)佩戴一次性手套。所有的溶液應(yīng)該存放在無(wú)菌的一次性塑料瓶或無(wú)核酸酶污染的玻璃瓶中。應(yīng)使用無(wú)核酸酶污染的吸管。

【注意】：用戶可直接購(gòu)買商業(yè)化或自行配制1×TE buffer, Nuclease-free；或直接購(gòu)買商業(yè)化或自行配制20×TE buffer, Nuclease-free。如果手頭是20×TE buffer, Nuclease-free，于實(shí)驗(yàn)前，用Nuclease-free water稀釋到1×TE buffer, Nuclease-free。

產(chǎn)品使用：

1.概述

在RiboGreen的RNA定量檢測(cè)中，為了獲得完全的線性動(dòng)力學(xué)范圍，需要使用兩個(gè)不同的染料濃度。在準(zhǔn)備RiboGreen的工作液之前（見(jiàn)下試劑準(zhǔn)備），需要先決定是希望測(cè)定高寬度實(shí)驗(yàn)（High-range assay）（20ng/mL-500ng/mL RNA），還是低寬度實(shí)驗(yàn)（Low-range assay）（1ng/mL-50ng/mL RNA），或兩個(gè)范圍都要檢測(cè)。

2.試劑準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，在無(wú)菌的一次性聚丙烯塑料管內(nèi)制備RiboGreen的水溶性工作液。避免使用玻璃器皿，因RiboGreen可能粘附到玻璃表面。制備好的RiboGreen工作液需避光保存。最好在工作液配制后數(shù)小時(shí)內(nèi)用完，不要長(zhǎng)期保存待用。

3.準(zhǔn)備RNA標(biāo)準(zhǔn)曲線

對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以使用商業(yè)化的RNA Standard，比如：普遍使用的16S和23S核糖體RNA；或其它純化的RNA制品。有的時(shí)候，推薦使用與待測(cè)定樣本類似的RNA標(biāo)準(zhǔn)來(lái)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。一般來(lái)說(shuō)，絕大多數(shù)單鏈的RNA分子能產(chǎn)生幾乎等同的熒光信號(hào)。在核苷、鹽、尿素、乙醇、氯仿、去污劑、蛋白質(zhì)和瓊脂糖這些常見(jiàn)的污染核酸試劑的化合物存在時(shí)，RiboGreen的檢測(cè)結(jié)果仍可維持良好的線性關(guān)系，即使熒光強(qiáng)度可能會(huì)受到影響（見(jiàn)附表1）。為了確保達(dá)到有效的對(duì)照，用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的RNA溶液應(yīng)該與待測(cè)樣本保持一致，這樣能保證含接近相似水平的雜質(zhì)化合物。

3.1在塑料瓶中用1×TE buffer配制濃度為2 μg/mL RNA溶液。用比色杯在1cm長(zhǎng)度通路下測(cè)量該RNA溶液在260 nm (A260)下的基本吸光值，A260＝0.05相當(dāng)于RNA濃度2 μg/mL。

3.2制作High-range標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，通過(guò)稀釋2 μg/mL RNA溶液配制一系列的2×終濃度RNA標(biāo)準(zhǔn)溶液至一次性無(wú)核酸酶的塑料管中，最后轉(zhuǎn)移到比色皿或培養(yǎng)板中。

3.3制作Low-Range標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，通過(guò)稀釋2 μg/mLRNA溶液配制一系列的2×終濃度RNA標(biāo)準(zhǔn)溶液至一 次性無(wú)核酸酶的塑料管中，最后轉(zhuǎn)移到比色皿或培養(yǎng)板中。

3.4等體積混合RiboGreen試劑工作液 （見(jiàn) 2-試劑準(zhǔn)備）和2×RNA標(biāo)準(zhǔn)溶液。于室溫避光孵育2-5min。務(wù)必確保測(cè)量容器內(nèi)加入了足夠體積的測(cè)量液，對(duì)10×10mm比色皿來(lái)說(shuō)，不能低于2 mL；對(duì)96孔板的各孔來(lái)說(shuō)，不要低于200 μL。

3.5選擇使用熒光光度計(jì)或熒光酶標(biāo)儀來(lái)測(cè)定樣本熒光值，選擇標(biāo)準(zhǔn)的熒光素波長(zhǎng)（激發(fā)~480nm，發(fā)射~520nm）。

3.6將每個(gè)樣的熒光值減掉空白的熒光值。之后使用校正好的熒光值為縱坐標(biāo)，RNA濃度為橫坐標(biāo)，來(lái)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4.樣本分析

4.1用1×TE buffer稀釋樣品到合適體積（比如：1.0 mL到10×10 mm比色杯或100 μL到96孔微孔板）。最好每個(gè)待測(cè)樣本做不只一個(gè)稀釋倍數(shù)。

待測(cè)樣本稀釋倍數(shù)越高，越有助于降低特定污染物的干擾作用。然而,也要避免特別小的樣本體積，因?yàn)殡y以準(zhǔn)確測(cè)量。另外，同一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，雜質(zhì)水平盡量保持一致，要降低雜質(zhì)引起的樣品之間信號(hào)差異。 例如，如果一系列RNA樣品含鹽濃度相差很大，那么它們就無(wú)法用一個(gè)簡(jiǎn)單的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)進(jìn)行比較。為了避免這樣的問(wèn)題，如果可能，調(diào)整所有樣品中雜質(zhì)濃度到相同水平。（見(jiàn)5-樣本中的DNA清除）

4.2每個(gè)樣品中加入等體積的RiboGreen測(cè)量試劑（見(jiàn)2-試劑準(zhǔn)備），于室溫避光孵育2-5min。

4.3選擇與標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定時(shí)相同的儀器參數(shù)來(lái)測(cè)定樣本熒光值。為了降低光漂白效應(yīng)，所有樣本的熒光測(cè)定時(shí)間保持不變。

4.4將每個(gè)樣的熒光值減掉空白的熒光值。根據(jù)已經(jīng)產(chǎn)生的RNA標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)確定樣本的RNA濃度。

4.5可能的話，通過(guò)做不同的樣本稀釋再重復(fù)測(cè)定，來(lái)驗(yàn)證定量結(jié)果。

5.樣本中的DNA清除

RiboGreen也可以結(jié)合DNA?？梢韵扔脽o(wú)RNA酶的DNA酶來(lái)去除樣本中的DNA，從而避免由于DNA和RiboGreen結(jié)合產(chǎn)生的熒光干擾，確保樣品中的熒光全部來(lái)自RiboGreen和RNA的結(jié)合。

5.1準(zhǔn)備10× DNase digestion buffer：無(wú)核酸酶的200 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM MgCl₂ , 20 mM CaCl₂。

5.2向每個(gè)含DNA樣品中加0.11倍體積的10×DNase digestion buffer。（例如，如果樣品為9 mL，就加入1mL的10× buffer）。

5.3按照1 μg DNA添加~ 5 unit的無(wú)RNase的DNase I。

5.5 37°C孵育90min。

5.5用1×TE buffer至少10倍稀釋樣品以降低消化液中殘留鹽離子對(duì)RiboGreen測(cè)量產(chǎn)生干擾。

5.6按照上述步驟進(jìn)行RiboGreen測(cè)定實(shí)驗(yàn)。

附表1 RNA制備產(chǎn)物中常見(jiàn)污染化合物對(duì)RiboGreen定量的影響

注意事項(xiàng)：

1.      操作過(guò)程中，需注意防止RNase污染RiboGreen RNA Reagent。使用潔凈的一次性手套來(lái)處理所有材料。

2.      目前尚無(wú)關(guān)于RiboGreen對(duì)人體的致突變性或毒性的數(shù)據(jù)。由于該染料與核酸結(jié)合，應(yīng)當(dāng)被看作潛在誘變劑，使用時(shí)要小心謹(jǐn)慎。在處理DMSO儲(chǔ)存液時(shí)應(yīng)特別小心，因DMSO能促進(jìn)有機(jī)分子進(jìn)入組織。染料的廢棄處理應(yīng)當(dāng)符合當(dāng)?shù)氐囊?guī)定。

3.      為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。