pH熒光探針（紅 600，SE）

pH-dependent fluorescence, Red 600, SE

產(chǎn)品簡介：

pH熒光探針（紅600，SE）表現(xiàn)出與pH值相關(guān)的熒光變化。不同于大多數(shù)在高pH值下熒光增強的熒光染料，pH熒光探針（紅600，SE）在酸性環(huán)境下熒光強度得到增強。隨著pH值從中性向酸性降低，pH熒光探針（紅600，SE）的熒光急劇增加。其在細胞外的熒光較弱，這可能有助于減少實驗中的洗滌步驟。pH熒光探針（紅600，SE）是監(jiān)測細胞內(nèi)酸性區(qū)室，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體的強大工具。該探針在細胞外熒光較弱，但在吞噬體、溶酶體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等酸性區(qū)室內(nèi)熒光顯著增強。這種特性使得pH熒光探針（紅600，SE）能夠特異性地檢測細胞內(nèi)的酸性區(qū)室，降低信號變異性，提高成像和流式分析的準確性。此外，pH熒光探針（紅600，SE）還可以與綠色染料（例如GFP、Fluo-8、鈣黃綠素或FITC標記的抗體）聯(lián)合使用，進行多重細胞功能分析。由于其光譜特性與Texas Red相似，因此可以方便地使用Texas Red的常用濾光片組進行pH熒光探針（紅600，SE）的實驗。
保存條件: 

-20℃避光保存

 物理及光譜特性：

pH依賴性發(fā)射光譜和細胞染色：

     ：

 母液制備：

產(chǎn)品使用：

一、        儲備液配制

1.      蛋白儲備溶液（溶液 A）

將100μL反應(yīng)緩沖液（例：1M碳酸鈉溶液或1M磷酸鹽緩沖液，pH 9.0）與900μL目標蛋白溶液（例：如可能，抗體、蛋白質(zhì)濃度>2mg/mL）混合，得到1mL蛋白質(zhì)標記儲備液。

注意：

1)     蛋白質(zhì)溶液（溶液A）的pH值應(yīng)為8.5±0.5。如果蛋白質(zhì)溶液的pH值低于8.0，則使用1M碳酸氫鈉溶液或1M pH9.0磷酸鹽緩沖液將pH值調(diào)節(jié)至8.0-9.0的范圍。

2)     蛋白質(zhì)應(yīng)溶于pH 7.2-7.4的1×磷酸鹽緩沖鹽緩沖液（PBS）中。如果蛋白質(zhì)溶解在Tris或甘氨酸緩沖液中，則必須用1×PBS（pH7.2-7.4）進行透析，以去除廣泛用于蛋白質(zhì)沉淀的游離胺或銨鹽（如硫酸銨和乙酸銨）。

3)     不純抗體或用牛血清白蛋白（BSA）或明膠穩(wěn)定的抗體無法被很好地標記。疊氮化鈉或硫柳汞的存在也可能干擾偶聯(lián)反應(yīng)。疊氮化鈉或硫柳汞可通過透析或離心柱去除，以獲得最佳標記結(jié)果。

4)     如果蛋白質(zhì)濃度低于2mg/mL，則偶聯(lián)效率顯著降低。為獲得最佳標記效率，建議最終蛋白質(zhì)濃度范圍為2-10mg/mL。

2.      pH熒光探針（紅600，SE）儲備溶液 （Solution B）

將無水DMSO添加到pH熒光探針（紅600，SE）中，制成10mM儲備液。通過移液器吹打或渦旋充分混合。

注意：

在開始偶聯(lián)之前準備pH熒光探針（紅600，SE）儲備溶液（溶液B），現(xiàn)配現(xiàn)用。pH熒光探針（紅600，SE）原液長期儲存可能會降低染料活性。溶液B可在冰箱中避光、避濕儲存兩周，避免反復(fù)凍融。

二、        偶聯(lián)山羊抗小鼠IgG的實驗方案

1.      偶聯(lián)反應(yīng)：

1)     溶液B（染料）/溶液A（蛋白質(zhì)）按10：1的摩爾比混合：將5μL染料原液（溶液B，以染料原液為10mM為例）加入到蛋白溶液（95μL溶液A）中，混勻。假設(shè)蛋白質(zhì)濃度為10mg/mL，蛋白質(zhì)分子量為200KD，則蛋白質(zhì)濃度為0.05mM。

注意：

我們建議使用10：1摩爾比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白質(zhì)）。也可根據(jù)實驗需求，使用5：1、15：1和20：1的最佳染料/蛋白質(zhì)比例。

2)     在室溫下繼續(xù)旋轉(zhuǎn)或搖動反應(yīng)混合物30-60min。

2.      純化偶聯(lián)物（以使用 Sephadex G-25 色譜柱進行染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物純化為例）

1)     按照制造商的指導(dǎo)說明準備Sephadex G-25色譜柱。

2)     將上一步偶聯(lián)反應(yīng)得到的混合物裝載到Sephadex G-25色譜柱的頂部。

3)     當(dāng)樣品開始在頂部樹脂表面下方流動時，加入pH 7.2-7.4的PBS溶液。

4)     向所需樣品中繼續(xù)添加pH 7.2-7.4的PBS溶液，以完成色譜柱的純化過程。收集含有目標染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的洗脫液。

注意：

a)     如需立即使用，染料-蛋白偶聯(lián)物需要用染色緩沖液稀釋，并分裝以供多次使用。

b)     如需長期儲存，染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶液需要濃縮或冷凍干燥。

3.      鑒定目標染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物（確定pH熒光探針（紅600，SE）標記蛋白質(zhì)的取代度）

1)     測量吸收值

為了測量染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的吸收光譜，建議將樣品濃度保持在1-10μM的范圍內(nèi)，具體取決于染料的消光系數(shù)。

2)     讀取 280 nm和染料發(fā)射波峰處（pH熒光探針（紅600，SE）的 ?max = 597 nm）的 OD（吸光度）

對于大多數(shù)分光光度計，需要用去離子水稀釋樣品（來自色譜柱餾分），使 OD 值在 0.1 至 0.9 的范圍內(nèi)。280 nm 處的 OD（吸光度）是蛋白質(zhì)的最大吸收，而 597 nm 是pH熒光探針（紅600，SE）的最大吸收值。為了獲得準確的 DOS，請確保偶聯(lián)物不含非偶聯(lián)染料。

3)     計算DOS

注意事項：

1.      熒光探針均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2.      第一次使用時請分裝成小包裝后-20℃保存，以避免反復(fù)凍融。

3.      每種蛋白質(zhì)對染料與蛋白質(zhì)的比例需求各異，這同樣受染料特性的影響。過高的染料標記可能會削弱蛋白質(zhì)的結(jié)合親和力，而過低的染料/蛋白質(zhì)比例則可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的靈敏度下降。

4.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

本產(chǎn)品僅用于生命科學(xué)研究，不得用于醫(yī)學(xué)診斷及其他用途！