重組蛋白的保存方法和使用

無論是保存還是運輸，請避免反復凍融。反復凍融，冰晶會破壞重組蛋白的空間結構，導致蛋白變性形成多聚體和重組蛋白構象改變，從而加快了重組蛋白的降解速度。重組蛋白保存得當與否，直接決定了重組蛋白的活性使用效果。

一 溶解(凍干粉蛋白產品)

Step 1-離心：開蓋前離心試劑管，可以選用快速離心10000-12000rpmx30s 或者3000-3500rpmx5min，效果良好。凍干粉在運輸過程中可能會因顛簸而漂散并粘貼于管壁或管蓋上，所以在打開塑料瓶蓋前，需將凍干粉通過離心收集到管底，以便用很小體積的液體即可將凍干粉完全溶解。

Step 2-重懸：用推薦的稀釋液稀釋并重懸至0.1-1.0mg/ml，不可振蕩。這個步驟即為溶解步驟，非常重要。需要用推薦的稀釋液重懸，并確保重懸液到指定的濃度范圍，不可以進行渦旋振蕩。

Step 3-短期保存：該重懸液在2-8℃最長可保存1周，用于短期實驗，方便實驗取用。

Step 4-長期保存：如果實驗周期長于一周，或配制的重組蛋白一次用不完，需對其進行長期保存。方法是：將已重懸的細胞因子或蛋白用含載體蛋白，如0.1%BSA或者10%FBS或者5%HSA或者5%海藻糖的的溶液將重懸液進一步稀釋，然后分裝凍存于-20℃至-80℃。

二 稀釋

可以用PBS或者細胞基礎培養(yǎng)基配制，0.1%BSA或者10%FBS或者5% HSA或者5%海藻糖的稀釋液備用（確保無菌）?？梢允褂靡陨纤姆N稀釋液的任意一種稀釋重懸的蛋白溶液，稀釋濃度根據您的使用濃度確定，不要低于10ug/ml。即可分裝成小管，凍存在-20到-80度

三 蛋白產品的保存

幾種蛋白保存條件對比

短期保存：

儲存在4°C溶液中

將濃縮蛋白質儲存在單一溶液（如PBS），置于聚丙烯管或干凈的玻璃容器中，放在4°C冰箱保存。即提即用的蛋白溶液液非常適合如此保存。

優(yōu)點：蛋白容易獲得，可以快速進行實驗，且同一管樣品可重復取樣，這樣避免了因經常解凍而加速蛋白的降解。

缺點：在重復取樣時，溫度升高且暴露于環(huán)境中，可能會導致微生物污染，蛋白質失活和氧化。要避免這種情況，可以把蛋白質分成小份儲存，并加入蛋白酶抑制劑、抗菌劑和還原劑等。但也要根據自己蛋白的情況，如果你的蛋白是完整的膜蛋白或分泌蛋白,很可能分子內存在二硫鍵，為保證其完整性，應該存儲在氧化環(huán)境中。另外，儲存時間超過一個月的蛋白可以考慮扔掉。

長期保存：

方案一：加入冷凍保護劑，儲存在-20°C可以將蛋白保存在含有25-50% (w) 甘油或乙二醇溶液中。

優(yōu)點：在低溫下，蛋白質對微生物污染，蛋白酶降解和氧化反應更有抵抗力，容易保證其活性。用甘油或乙二醇稀釋使蛋白處于溶液中，可以方便取樣。此外，這種方式儲存的蛋白質可以保存長達一年。

缺點：蛋白質在-20°溶液中仍有可能遭受水解、污染和氧化，也需加入抑制劑、還原劑等。而且將樣品存放在50%冷凍保護劑中有時是不可取的，取決于你接下來要做的實驗。

方案二：凍存在-80°C或液氮中將蛋白質分裝成一次使用的量，快速冷凍。

優(yōu)點：可以長期保存（多年)，不需要甘油、疊氮化鈉等化學物質，避免蛋白質降解或微生物污染。

缺點：冷凍蛋白質應一次性使用，為了避免反復凍融發(fā)生降解。此外,抗體軛合物(特別是堿性磷酸酶復合物)冷凍后可能會失活。

方案三：凍干粉末將蛋白質脫水凍干成粉末，在冰箱中無限期存放。

優(yōu)點：蛋白質不會像在水溶液中發(fā)生會水解和其他形式的化學降解，凍干蛋白質的空間也比溶液要小，而且可以長期儲存。

缺點：凍干并不適用于所有蛋白質，與細胞膜相關的蛋白質容易被凍干破壞。而且，并非所有的蛋白質都凍干后都能保持穩(wěn)定性，有的可能會變性，從而減少它們的有用性和再溶解的能力。此外，一些蛋白質可能需要與蔗糖、甘露醇或BSA等才能保持穩(wěn)定。

蛋白儲存的幾個技巧

分裝：無論是冷凍還是儲存在溶液中，將蛋白進行分裝，以避免凍融，降低污染的風險。
高濃度：一方面高濃度蛋白能更能減少與塑料或玻璃結合，另一方面高濃度有利于蛋白質的穩(wěn)定?？梢詫⒌鞍诐饪s至1mg/ml以上，或選擇添加BSA等增加蛋白的濃度。
低溫：蛋白產品對溫度比較敏感。一方面在較低的溫度下，蛋白分子的熱運動較低，分子內部成鍵不容易斷裂；另一方面溶液中可能存在的蛋白酶活性較低，微生物不容易生長。
無菌：進行蛋白實驗時，一定要戴手套，為了防止細菌的生長，蛋白質最好保存在滅菌的小管中。
速凍與速融：蛋白質溶液保存中的冷凍過程，里面的純水首先會結為冰，這樣蛋白質分子就會被暴露在高鹽濃度或者pH環(huán)境下，蛋白的活性可能會破壞。因此，盡可能縮短冷凍的過程和時間。速凍可以在液氮中進行，也可以在干冰，乙醇和丙酮的混合物中進行。速凍后，蛋白質可以保存在-20度或-80度中。同樣的道理，蛋白質融化的過程也要盡可能的快速，可以在溫水中進行。
不可振蕩：震蕩產生的剪切力有可能會對蛋白質產生破壞作用。震蕩時溶液中會產生氣泡，氧氣的進入會導致蛋白質處在氧化環(huán)境中。蛋白質中含有半胱氨酸，其極易被氧化為胱氨酸，這一過程很可能會破環(huán)蛋白質的活性。這里所說的振蕩是指用渦旋儀進行快速振蕩(vortex)?？梢杂脴岊^輕輕吹打幾次助溶，也可以輕輕用手翻轉瓶子或把瓶子放在一個緩慢搖擺的搖床上，這樣做來保證緩沖液能夠接觸到瓶子的整個內壁。
保護劑：添加乙二醇或甘油等保護劑，使蛋白穩(wěn)定，防止結冰。抑制微生物的生長，添加硫柳汞01%(w / v)或疊氮化鈉0.05%(w / v)。阻止半胱氨酸氧化，可以加入1-5mM還原劑，例如DTT。
蛋白酶抑制劑：添加EDTA 、PMSF等蛋白酶抑制劑來減少蛋白質降解。

蛋白中常見的添加試劑

蛋白酶抑制劑：有蛋白酶抑制劑混合物，能夠抵抗多種蛋白酶的剪切和破壞。以下為常見的蛋白酶抑制劑

抗凍劑（例如乙二醇，甘油等）：25%-50%濃度加入，防止結凍產生冰晶。
抗菌劑：0.02-0.05%的疊氮化鈉或者0.01 %的硫柳汞，抑制微生物。
蛋白穩(wěn)定液：可用于蛋白冷藏或者冷凍保存，適用于酶類或者需要維持完整功能的蛋白。
金屬離子螯合劑（EDTA）或者還原劑（DTT），維持半胱氨酸還原狀態(tài)，防止被氧化。