陰性對照出現(xiàn)陽性結(jié)果

試劑/樣品污染

試劑和樣品可能被污染，或者由于孔之間的濺灑交叉污染。使用新鮮試劑，小心操作移液器。

夾心ELISA - 檢測抗體與包被抗體反應(yīng)

確定使用的是正確的包被抗體和檢測抗體,他們之間不會互相反應(yīng)。

酶標(biāo)板洗板不徹底

用洗液充滿板孔確保每孔被充分洗滌，洗板前確保所有的剩余抗體溶液被倒凈。

抗體量過多導(dǎo)致非特異結(jié)合

根據(jù)推薦用量使用抗體。盡量使用較少的抗體。

酶標(biāo)板整體背景高

結(jié)合反應(yīng)太強(qiáng)或時(shí)間過長

檢查底物的稀釋，使用建議的稀釋度。當(dāng)酶標(biāo)板顯色足夠進(jìn)行吸光度讀取時(shí)立即用終止液終止反應(yīng)。

底物溶液或終止液不是新配制

使用新配制的底物溶液。終止液應(yīng)該是清亮的（如果它變黃，這是被污染的標(biāo)志，需要重新配制）。

沒有終止反應(yīng)

如果底物反應(yīng)沒有被終止，顏色會繼續(xù)變化。

酶標(biāo)板在酶標(biāo)儀讀板前放置時(shí)間過長

顏色會繼續(xù)變化（盡管加了終止液，依然會以很慢的速度變化)。

試驗(yàn)器皿污染

確保試劑是新配的并且使用的是清潔的玻璃器

底物孵育過程沒有避光

底物孵育應(yīng)該在避光條件下進(jìn)行。

孵育溫度過高

抗體在適宜的溫度下有最佳的結(jié)合活性。確保孵育在正確的溫度下進(jìn)行，孵育箱要設(shè)定好適宜的溫度并正常工作。孵育溫度可能需要一些優(yōu)化。

抗體非特異性結(jié)合

確保進(jìn)行了封閉并使用的是恰當(dāng)?shù)姆忾]液。我們建議使用 5-10% 的與二抗同種動物來源的血清或牛血清。

確保板孔經(jīng)過預(yù)處理以防止非特異結(jié)合。使用親和力強(qiáng)、純度高的抗體，最好經(jīng)過了預(yù)吸收。

請檢查針對“陰性對照出現(xiàn)陽性結(jié)果”的建議

吸光度數(shù)值低

使用的樣品中沒有顯示出靶蛋白或者靶蛋白顯示的水平低

檢查靶蛋白表達(dá)系統(tǒng)，確保它在您的樣品中被表達(dá)出來。如果靶蛋白的表達(dá)水平低，需要增加樣品使用量，或者您可能需要選擇

一個(gè)更靈敏 的測定方法。確保您使用的是沒有超出測定方法檢測范圍的陽性對照。

抗體不足

確定使用的是建議的抗體量，為了使結(jié)果更好可能需要增加抗體的濃度。

底物溶液不是新鮮配制或成分有誤

使用前新鮮配制底物溶液。確保儲備液在有效期內(nèi)并且被正確儲存，使用的濃度也是正確的。確保試劑按正確的濃度使用。

試劑不是新鮮配制或pH值有誤

確保試劑配制正確并在有效期內(nèi)。

孵育時(shí)間不夠長

如果建議了孵育時(shí)間，確保按推薦的時(shí)間長度孵育抗體。為了使結(jié)果更理想，孵育時(shí)間可能需要增加。

孵育溫度太低

抗體在適宜的溫度下有最佳的結(jié)合活性，確保孵育是在正確的溫度下進(jìn)行，孵育箱要設(shè)定好適宜的溫度并正常工作。孵育溫度可能需要一些優(yōu)化。確保所有的試劑在使用前是室溫。

未加終止液

加入終止液可以增加顯色反應(yīng)的強(qiáng)度，也能固定反應(yīng)最終的顏色。

吸光度數(shù)值高

樣品和/或陽性對照吸光度數(shù)值高。吸光度沒有按樣品在板子上的稀釋度遞減。

樣品或陽性對照的濃度過高，超出了試驗(yàn)方法檢測的范圍。重新設(shè)置試驗(yàn)方法或者在加樣前通過稀釋降低樣品和對照的濃度，在處理結(jié)果計(jì) 算濃度時(shí)考慮到所作的稀釋。

酶標(biāo)板上吸光度不規(guī)律

孵育時(shí)酶標(biāo)板疊在一起酶標(biāo)板疊在一起使板子每個(gè)孔的溫度不能平衡一致，請避免堆疊。

吸液不一致

確保移液器使用正確并經(jīng)過校準(zhǔn)、確保槍頭插得足夠緊密。板子稀釋時(shí)要特別仔細(xì)，注意確保每個(gè)槍頭都吸上和排出正確量的液體，這對平 行樣品結(jié)果的一致性有很大影響。

抗體稀釋液/試劑未混勻

為保證板子所有孔的濃度一致，確保所有的試劑和樣品在加到板子上以前都被混合均勻。

板孔變干涸

確保所有孵育期間酶標(biāo)板始終被蓋好。放置一個(gè)潮濕的水盤(保持清潔，無菌水)在孵育箱的底部。

洗板不充分

這將導(dǎo)致一些孔沒有其他孔清洗的好，殘留不同量的未結(jié)合的抗體，使后面的結(jié)果產(chǎn)生不一致。

酶標(biāo)板底部不凈影響吸光度讀取

讀板前小心清潔酶標(biāo)板底部。

顏色變化過慢

酶標(biāo)板未處于恰當(dāng)?shù)臏囟戎写_保酶標(biāo)板處于室溫，試劑在使用前也處于室溫。

結(jié)合能力太弱

使用前新鮮配制底物溶液。確保儲備液在有效期內(nèi)并且被正確儲存，使用的濃度也是正確的。確保試劑按正確的濃度使用。

溶液污染

例如象疊氮化鈉和過氧化物酶這類污染物的存在，將會影響底物的反應(yīng)，避免使用含有這些防腐劑的試劑。