細胞培養(yǎng)板依底部形狀的不同可分為平底和圓底（U型和V型）；培養(yǎng)孔的孔數(shù)有6、12、24、48、96、384、1536 孔等；根據(jù)材質(zhì)的不同有Terasaki板和普通細胞培養(yǎng)板。具體選擇時根據(jù)培養(yǎng)細胞的類型、所需培養(yǎng)體積及不同的實驗?zāi)康亩ā?/span>

（一）平底和圓底（U型和V型）培養(yǎng)板的區(qū)別和選擇：
貼壁細胞一般用平底培養(yǎng)板。懸浮型細胞的培養(yǎng)一般用V型。
U型培養(yǎng)板亦多用于培養(yǎng)懸浮型細胞 。V型培養(yǎng)板有時用做免疫學(xué)血凝集的實驗。
不同型狀的板子自然有不同用途。平底的什麼類型的細胞都可用﹐但當(dāng)細胞數(shù)目較少﹐如做克隆時﹐就用96孔平底板﹐另外﹐做MTT等實驗時﹐無論貼壁和懸浮細胞﹐一般均用平底板。至於U或V型板﹐一般在某些特殊要求時才使用。如在免疫學(xué)方面﹐當(dāng)做兩種不同淋巴細胞混合培養(yǎng)時﹐需要二者相互接觸以刺激﹐因此﹐一般需要U型板﹐因細胞會由於重力的作用而聚集在一個很小的範圍內(nèi)。V型板的用途更少﹐一般用于細胞殺傷實驗時﹐為了使效靶細胞緊密接觸﹐常使用V型板﹐但這種試驗也可用U型板替代(加入細胞後﹐低速離心)如果是養(yǎng)細胞的話， 通常是選用平底的， 另外要特別注意材質(zhì)， 標示"Tissue Culture (TC) Treated"就是養(yǎng)細胞用的。
圓底的好像沒聽說過拿來養(yǎng)細胞。 圓底的通常是拿來做分析， 化學(xué)反應(yīng)， 或是保存樣品用的， 因為圓底比較好將液體吸得乾淨(jìng)， 如果用平底的就不好吸了。 不過， 如果你是要測吸光值的話， 一定要買平底的才行。
大部分細胞培養(yǎng)都用平底培養(yǎng)板，便于鏡下觀測、有明確的底面積、細胞培養(yǎng)液面高度相對一致，還便于MTT檢測。
圓底培養(yǎng)板主要用于同位素摻入的實驗，需要用細胞收集儀收集細胞的培養(yǎng)，如“混合淋巴細胞培養(yǎng)”等。
（二）問題集錦
問：我看到培養(yǎng)板有4、6、12、24、48、96孔幾種規(guī)格 ，但不知道到底什么實驗用哪種規(guī)格，請指教。
答：要根據(jù)你具體的實驗要求，流式一般用6孔，MTT一般用96孔，細胞爬片一般用24孔等！要具體根據(jù)你實驗來定！
問：請問哪位高手知道Terasaki板是什么培養(yǎng)板，與普通細胞培養(yǎng)板有什么區(qū)別？謝謝！！
答：Terasaki plate主要是用于晶體學(xué)研究，產(chǎn)品設(shè)計便于對晶體的觀察與結(jié)構(gòu)分析。有兩種sitting 和handing drop兩種方法，兩種方法應(yīng)用產(chǎn)品的外形結(jié)構(gòu)也不同。材料上選擇crystal class polymer ，特殊的材料有利觀察晶體結(jié)構(gòu)。
細胞培養(yǎng)板主要是PS材料。材料是treated sufface。便于細胞貼壁生長與伸展。當(dāng)然還有浮游細胞的生長材料，同時還有l(wèi)ow binding surface，有關(guān)更多實驗材料上的應(yīng)用與對材料的選擇。
問：我想測吸光度用酶標儀，用多孔細胞培養(yǎng)板行嗎？請問酶標板 多孔細胞培養(yǎng)板有什么區(qū)別？
答：用多空細胞培養(yǎng)板測吸光度肯定可以拉，我們經(jīng)常用它來做樣品的蛋白定量和MTT檢測。
區(qū)別：酶標板一般要比細胞培養(yǎng)板貴，細胞板主要做細胞培養(yǎng)，但也可以用來測蛋白濃度；酶標板包括包被板和反應(yīng)板，一般不能用做細胞培養(yǎng)，它主要做免疫酶聯(lián)反應(yīng)后的蛋白檢測，它需要更高的要求還需要特定的酶標工作液。如下是個用酶標板檢測冠狀病毒IgM/IgG抗體例子：見網(wǎng)站
常用不同培養(yǎng)板的孔底面積及推薦加液量：不同孔板所加培養(yǎng)液的液面都不宜太深，一般在2-3mm范圍，結(jié)合不同孔的底面積就可算出各培養(yǎng)孔的適宜加液量。若加液量過多會影響氣體（氧氣）交換，而且在搬動過程中易溢出造成污染。具體所加細胞密度依實驗的目的不同靈活掌握。
培養(yǎng)器皿       面積（cm2）培養(yǎng)液量（ml）  細胞量
96 孔培養(yǎng)板   0.32  0.1   10e5
24孔培養(yǎng)板  2  1.0   5×10e5
12孔培養(yǎng)板  4.5  2.0   10e6
6孔培養(yǎng)板  9.6  2.5   2.5×10e6
3.5 cm 培養(yǎng)皿  8  3.0   2×10e6
6 cm 培養(yǎng)皿  21  5.0   5.2×10e6
10 cm 培養(yǎng)皿  55  10.0   13.7×10e6
25cm2 培養(yǎng)瓶  25  5.0   5×10e6
75cm2 培養(yǎng)瓶  75  15～30   2×10e7
(一)細胞培養(yǎng)板的密閉和污染問題：
細胞培養(yǎng)板的加樣和操作：細胞培養(yǎng)板在進行細胞操作時同樣遵循嚴格無菌的原則，各項操作要保證規(guī)范、科學(xué)，不對細胞的生長造成額外的影響。這其中最常見的問題就是如何保證加樣后細胞的均勻和盡量減少換液對細胞生長狀態(tài)的影響。
問：96，24孔培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿的蓋子都很松，這樣是方便了透氣，但是細菌、霉菌等污染物會不會也隨著溜進去呢？
答：1.蓋子很松，屬于半開放培養(yǎng)，這樣的目的是透氣（實際上是為了使培養(yǎng)皿外的co2能夠與培養(yǎng)皿充分交換，維持培養(yǎng)基的pH值）。
2.凡事有利必有弊，這樣當(dāng)然增加了污染的可能性。此外這樣還會使培養(yǎng)皿內(nèi)的液體蒸發(fā)，這對于精確定量的藥物來說就顯得值得注意了。所以以下二條措施是必須的a培養(yǎng)箱內(nèi)空氣必須清潔（定期紫外線照，酒精擦洗，盡量少開關(guān)培養(yǎng)箱）b培養(yǎng)箱內(nèi)的濕度必須始終保持為100%（培養(yǎng)箱內(nèi)放置無菌蒸餾水的水槽）。
就好像培養(yǎng)皿，也是一個蓋倒扣的容器，也不會污染。主要是因為蓋子“L”型邊緣產(chǎn)生氣流負壓的緣故，灰塵上面才附著有微生物，而氣流攜帶的灰塵是無法通過產(chǎn)生負壓的蓋邊緣的。而透氣作用只是通過空氣的擴散，不會產(chǎn)生氣流，所以只會透氣不會透菌。
我使用24孔板，在其中的某些孔中有操作(在超凈臺內(nèi))，而其他孔中還有細胞要培養(yǎng).我很擔(dān)心這樣會污染，不知道要注意什么?大家不知道有什么好的建議。
在超凈臺內(nèi)如果操作規(guī)范的話應(yīng)該可以的，我想你可以充分利用培養(yǎng)版的蓋子，盡量只暴露要操作的孔，將其他孔用蓋子蓋起來。這是我的一點粗淺的見解，拋磚引玉吧！
使用前綜合考慮一下，充分使用所以的孔；如果只需要使用少數(shù)的孔可以只用一邊的，其余用蓋子蓋住，我習(xí)慣于先用右側(cè)的孔（右手加樣方便）。
其實自己感覺只要注意無菌操作，一般是不會污染的。操作時用幾塊玻片把板子一側(cè)墊高，不要把蓋子全打開，一般沒問題。
(二)細胞分布不均及解決辦法：
問：我的細胞接種培養(yǎng)板，細胞總是聚集在周邊部分，該如何處理啊？我看園子里有的戰(zhàn)友的細胞卻是聚集在中間，是不是板子的質(zhì)量問題?。?/span>
答：請問你的細胞是如何混勻的？是滴管吹打還是振蕩培養(yǎng)板？如果是后者，而且是轉(zhuǎn)圈搖勻的話，很有可能由于離心力的作用使細胞甩到周邊部分，導(dǎo)致細胞中間少，四周多！自己可是試試！
周邊一般是相對會多一點，但是中間的數(shù)量也不會很少啊~~ 鋪板的時候我也沒有特異去振蕩培養(yǎng)板。
大概是板子的質(zhì)量問題吧或者是不是鋪板時候的細胞密度太低了？我用的corning的板 。
一個好辦法：在你培養(yǎng)種板之前，把培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱里進行幾個小時的飽和后再取出，種入細胞時力量要輕，可采取用滴頭在培養(yǎng)板孔的側(cè)面慢慢加入讓細胞懸液流入板孔中，培養(yǎng)的細胞基本是均勻生長。記住千萬不要用振蕩器振蕩，否則你的細胞就會想你說得那樣聚積在一起。
我今天把培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱里幾個小時，適當(dāng)?shù)陌鸭毎芏燃哟罅艘幌拢硗舛嗉恿艘稽c培養(yǎng)液，今晚看細胞鋪的挺好的。
我認為有兩種可能解決你問題的辦法:
1.加入前吹打均勻;
2.從多孔板側(cè)邊或底邊緩慢加入。
我在做原代培養(yǎng)時也遇到過這種情況，我一直以為培養(yǎng)皿鋪膠不均勻會導(dǎo)致這種現(xiàn)象，因為混勻的血管段加入到培養(yǎng)皿中時，在相差顯微鏡下血管段均勻分布在培養(yǎng)皿中，24h后貼壁的血管段就是周邊多，中間相對少些。下次我要試試hkqu戰(zhàn)友的方法看能否改變這種現(xiàn)象。謝謝指點！
這種現(xiàn)象很正常呀，不知你仔細觀察過沒有，孔直徑愈小，這個現(xiàn)象越明顯，我試過，24、96孔板這種現(xiàn)象不可避免，因為液體的附壁使得孔內(nèi)培養(yǎng)液不是成一個液平面，而是周邊高，就像凹鏡一樣，而使用這兩種孔板由于需要加干預(yù)等原因而不能加足量培養(yǎng)液，使得細胞隨培養(yǎng)液一起出現(xiàn)“邊集”現(xiàn)象，如果為了使孔中央也有均勻細胞而增加接種細胞數(shù)量的話，這要看你需要觀察何種指標，如果是MTT ，免疫組化的話會因為細胞成層而影響結(jié)果。
贊成hkqu戰(zhàn)友的建議，個人認為消化細胞時要注意吹打均勻，避免細胞成團，而且孔內(nèi)培養(yǎng)液量要足夠，我一般接種時加足量培養(yǎng)液，加干預(yù)時換一次液，干預(yù)液加培養(yǎng)液量等于接種時培養(yǎng)液量，這樣的話“邊集”現(xiàn)象會有所改觀，不妨一試。
我想我們做課題，實驗的目的是為了驗證或探索某些理論，而不是要所謂的“好看”，“美”。還記得魯迅先生的文章《藤野先生》一文嗎？我們很多年以前學(xué)過的，藤野先生對魯迅先生說得話大家不防重溫一下，我想這正是我們要學(xué)習(xí)的地方。
我做的是空斑形成實驗，最好是細胞鋪成均勻的一層，昨天接種病毒時大部分孔都還好，個別的不太均勻。
現(xiàn)在我細胞實驗也做了一段時間了，但在實驗中平行組的差距還是比較大。
有時候一組數(shù)據(jù)大多是差不多的，偏偏會跳出一個相去甚遠的數(shù)據(jù)。
我想應(yīng)該不是我細胞加入時的問題，因為我的組間差距大是出現(xiàn)在加樣的組中，而對照組的數(shù)據(jù)卻相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定。另外，我的樣品是完全均勻的液體，照理應(yīng)該是不會出現(xiàn)上述問題的。
我也出現(xiàn)了這樣的問題。我加入細胞的時候是用吸管邊吹打邊用一毫升的槍加入12孔板中的，可是組內(nèi)差異仍然很大，想請教一下大家加細胞的時候都有什么方法呀？
我覺得有幾點：
1.細胞消化后吹打成單細胞懸液很關(guān)鍵！保證分板時每個孔的細胞數(shù)目是一致的！
2.當(dāng)然還有你的處理因素各個孔之間的平行也很重要，比如說加藥時，藥物稀釋后混勻，保證每個孔的濃度是一致的！
3.再者加細胞和藥物時，要試驗組和對照組一塊輪流加，避免加樣先后順序?qū)е录毎芏群退幬餄舛鹊牟町悾。?/span>
吹打已經(jīng)是均勻了，但是鋪板，6孔，24孔總有些不均勻的哦，有點愛往中間集中。而且明明計數(shù)好了鋪了，長一兩天，各個孔密度就有點不一樣，對檢測有影響，能指教一下，有良策嗎？
1.如果用巴氏吸管鋪的話，每次吸取的量不要太多，因為吸管內(nèi)的細胞會自動向下沉，往往第一開始幾個孔細胞數(shù)多，經(jīng)常均勻細胞懸液，加液走S型路線。
2.如果用移液器的話，tips要處理下，把尖端去掉避免損傷細胞，這樣每一次取液對應(yīng)一個孔。用tip一對一孔加入比較準確。但也要注意混勻懸液。
3.設(shè)立平行組，n要足夠大（可以計算一下）。
4.鋪板后不要搖，因為搖動會導(dǎo)致細胞向中間聚集。最好鋪板一次搞定。
鋪板后不要做圓周的晃動，做十字晃動，即上下左右晃動，否則會使細胞旋到當(dāng)中去。
移液器的槍頭沿著培養(yǎng)板壁加，就不會集中到中間了。
(三)6孔板接種和換液：
問：我的細胞傳代很正常，但一種到六孔板里（不管加藥和對照），總有兩三個孔（隨機）細胞長得不好，很小，像破碎了。有人遇到過這種情況嗎？到底是啥原因呢？請各位指點
答：可能跟你加液的溫度有關(guān)。如果你細胞剛剛拿出來換液加液，培養(yǎng)基也是從4度冰箱拿出來不久，很容易細胞就會凍死了。建議你最好把培養(yǎng)基先在培養(yǎng)箱里邊孵育15min先。
另外，跟你細胞的生長狀態(tài)也有關(guān)。加藥之前的細胞可以用高點的血清濃度培養(yǎng)。保證細胞狀態(tài)良好。
或者放在37度水浴鍋里孵育也可以，或者是培養(yǎng)板本身的問題，你再換換其他培養(yǎng)板試試看。再有可能就是細胞狀態(tài)問題了，種板時的血清濃度調(diào)高試一下
問：最近幾天，我用六孔培養(yǎng)板接種細胞，培養(yǎng)24小時后更換培養(yǎng)基，在更換培養(yǎng)基之前，顯微鏡觀察到細胞貼壁，狀態(tài)非常的好，更換了培養(yǎng)基后，立即用顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)每個孔中都近乎有一半的細胞表現(xiàn)出近乎死亡的狀態(tài)。細胞變得非常小，產(chǎn)生大量的碎片，而另一半的細胞一切正常，異常細胞與正常細胞之間存在一條分水嶺，上半個圓是好的，下半個圓就不好，這是怎么一回事？
答：你可以看一下是不是培養(yǎng)板沒放水平。有一回我也出現(xiàn)過這種情況。
你的培養(yǎng)液如何，如果培養(yǎng)液過期，細胞就不會貼壁。換一點新配制的培養(yǎng)液試一試。
我也經(jīng)常碰到，我想可能是板的問題，換一個牌子的板或換用培養(yǎng)瓶就沒問題了。
不知樓主所需換液的培養(yǎng)板多不多，換培養(yǎng)基的時候如果沒有注意風(fēng)機的影響，特別是所需換液的培養(yǎng)板很多時，容易使細胞因風(fēng)吹失水而干縮破裂。如果如此，換液時應(yīng)該逐個培養(yǎng)板進行，別怕浪費吸管，注意操作的效率！
(四)24孔板接種：
問：我把細胞消化接種到24孔板之后，已經(jīng)四天了，老是每孔的中間部分長不滿，每天換液時都用PBS 清洗，第二天換液時都出現(xiàn)同樣的情況，每孔的邊緣長的很好，中央大量死細胞，我也不知道是什么原因，請各位高手仁兄給把把脈，先謝過！?。。。。。?！
答：是中央長不滿，還是中央有和邊緣相同密度的細胞，但是大部分都是死細胞？如果是前者，也許不是技術(shù)問題，而是物理問題了。
我是選擇孔內(nèi)鋪蓋玻片，在玻片上種植。每次換液都用PBS洗，必要的步驟嗎？另外，也有可能和細胞種類有關(guān)或者和培養(yǎng)液有關(guān)？
我想你的培養(yǎng)液可能加的太少了。由于表面張力的作用，培養(yǎng)板的邊緣液體會向上走，造成培養(yǎng)液面呈現(xiàn)一個凹面（就像量筒的液體凹面一樣），中央的細胞正好在凹面的最低處，培養(yǎng)液少，細胞的營養(yǎng)不夠，甚至干涸掉，空氣中的氧氣也會造成損傷，即使有增值過來的細胞也會死掉。
估計你的培養(yǎng)液里可能有貴重的“銀子”（因子）啊，想少用點吧，結(jié)果就…… ：）
另外，檢查一下培養(yǎng)箱底部的水是否少了，如果少了，箱內(nèi)的空氣濕度不夠，會造成培養(yǎng)液揮發(fā)加快，這樣即使剛加的液體不少，過一段時間，由于蒸發(fā)，液體量會減少，造成中央干涸。并且這樣會改變了培養(yǎng)液的成分濃度，造成滲透壓過高。
個人經(jīng)驗認為這是物理問題:24孔板小，細胞接種進去后是很難搖均勻的，結(jié)果導(dǎo)致細胞重貼壁后呈現(xiàn)四周密中間稀的狀況.
至于中間較多死細胞，如果是懸浮狀的話，也一樣是物理問題。接種后比較粗暴的碰撞，似乎對搖均勻細胞有一定效果.
在為多孔板培養(yǎng)的細胞換液時一定要注意，不要把培養(yǎng)基吸得太干，如果完全吸取，很容易造成細胞干涸，這樣的話細胞會很快死亡。我有一段時間總是遇到這個問題，一個板子中總有一兩個孔出現(xiàn)細胞大量死亡，后來發(fā)現(xiàn)是上面的原因?，F(xiàn)在我做的時候如果必須把液體吸干，我會一個一個空來吸取，最多一次不超過3孔，然后馬上加入液體，同時在作轉(zhuǎn)染時，我會在吸液和加液時將風(fēng)機關(guān)掉，這樣基本上會避免細胞死亡。
同時你所說的細胞周圍密而中間稀疏，大約有如下原因：
1.培養(yǎng)液加得太少。主要是由于液體張力的問題。
2.細胞接種后震蕩太厲害了。由于離心力作用導(dǎo)致細胞分布到周圍。
我的細胞在接種在24孔板上時，孔的 周圍細胞密集，中間細胞稀少，我試了很多次均如此。請問怎樣操作才能使細胞分布均勻？
周圍細胞密集，中間細胞稀少
這種情況一般是種板時培養(yǎng)液過少，液面總是呈一凹面，如果液面過低，孔中間就基本上沒什么細胞，所以種板時一定不能吝嗇培養(yǎng)液，待貼壁后可以用比較少量的培養(yǎng)液處理
周圍細胞稀少，中間細胞密集:這種情況一般是種板后過于晃動，特別是旋轉(zhuǎn)著晃動.有人才用十字方向的晃動方法使細胞分散均勻.但我個人認為，將細胞加入孔后，用槍或移液器充分吹打混勻后就不用，也不能再晃動，甚至拿著孔板走路帶來的震動都會讓細胞往中間集中.
當(dāng)然，無論是哪種情況，首先都需要保證細胞在種板時時均勻分布的，即種板時的細胞懸液一定要混勻
細胞分布均勻與否有一點很關(guān)鍵，即每種細胞是有個體差異的，別人的細胞操作不一定適合于你.所以要靠自己摸索，且找出專屬于自己細胞的一套規(guī)律，就我個人而言，有如下經(jīng)驗：
1.所有待接種的細胞懸液在種板前一定要用吸管混勻。
2.按資料記載，24孔板的液體量為1ml，個人也覺得1ml的量足矣。
3.接種時，要慢慢加樣，且記得輕微旋轉(zhuǎn)槍頭，這樣做對細胞均勻分布有一定效果。
4.接種后最好直接放入培養(yǎng)箱讓細胞適應(yīng)培養(yǎng)板這個新的環(huán)境，個人認為沒有必要在室溫放置一段時間。
5.根據(jù)細胞的特性，細胞均喜歡聚集在邊緣生長，所以我考慮到，你的問題還有可能是接種時的細胞密度不夠，導(dǎo)致周邊密集，中間稀疏的錯覺。你的拌種密度是多少？
另"要慢慢加樣，且記得輕微旋轉(zhuǎn)槍頭"的意思就是:加樣不能太快，避免細胞在一個加樣處聚集，且注意在不同的部位進行加樣，即邊加邊活動槍頭，人為使細胞趨于均勻分布，我個人覺得有一定的效果，不知這次我解釋清楚沒有。
五)96孔板細胞接種換液和收集細胞
問：最近我用96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)腫瘤細胞，結(jié)果細胞長得不是很理想，不是長得不均勻，就是每個孔細胞生長速度不一樣。另外，鏡下觀察細胞輪廓很不清晰，怎么調(diào)焦距效果都不好。（板子是剛拆封的。）不知道怎么回事？
答：You should make sure that you triturate the cells very well. If the cells tend to form clumps， use a pasteur pipet and pass the cells several times. Then count the cell using Trypan Blue. Plate 1-5*10^4 per well， depending on your desired density. Usually， only the 60 wells in the middle should be used for plating cells. Wells on the edge will have a decreased volume of media， so you should not add any cells in there， but you still need to put media or H2O inside those 36 wells.
首先你要盡可能把消化細胞消化成單個細胞（不要成團），反復(fù)吹打，掌握好時間（不同的細胞要摸索的），種細胞時要均勻的吸取，清清的吹打一遍再吸取細胞，這樣也許會解決您的問題。我以前也是出現(xiàn)這樣問題。后來就很好了?。?/span>
種到96孔板的細胞一定要消化成單個細胞，建議用EDTA和胰酶消化。加血清后反復(fù)吹打。細胞量盡量少一點。
我一般在鋪板時都是用八排槍加樣的，感覺效果還不錯。首先如樓上所說要把細胞消化的恰到好處，背著光看瓶底細胞都下來后再對著瓶壁吹打幾次即可。然后將細胞懸液轉(zhuǎn)移到加樣槽中，在加樣過程中，要不停的輕輕晃動加樣槽，且在每次吸樣前都吹打幾次，以防細胞不是均勻的分散在培養(yǎng)基中，造成加樣不均。加樣時使槍頭貼著孔壁緩慢加入，使液體自然流滿即可。都加完后平穩(wěn)拿到鏡下觀察鋪的很漂亮的。聽別人說鋪完后在96孔板的四個角輕輕磕幾下，但我試過，這樣效果反倒不好！
我覺得你的問題可能是消化的不好，我的經(jīng)驗希望能有幫助：
1、對細胞的選擇要注意，要選擇狀態(tài)好的細胞，密度要選分布瓶底80％為宜；
2、消化時，不要忘了用PBS（或純的不含血清的培養(yǎng)基）洗一遍，加0.25％的胰酶1ml消化2-3分鐘（不同的細胞有差別，你要摸索），還要不時的活動，讓胰酶分布到每個角落，之后傾去胰酶，加3ml培養(yǎng)基（我認為加血清過于粘稠，不宜吹打，加培養(yǎng)基后稀釋胰酶可不考慮對細胞的損傷），吹打成單個細胞；
3、接種時要注意細胞密度，多數(shù)細胞要求0.5-2的10的4次冪，這也要摸索一下（簡單：就是你種一個密度，如果在你測指標時細胞沒過多影響結(jié)果就行）；
4、周邊的孔不要做指標檢測孔，你有沒有發(fā)現(xiàn)周邊的孔的細胞2天后狀態(tài)就明顯不好了；
5、接種細胞調(diào)整好濃度后，要一邊吹細胞懸液一邊接種；
6、還有你說看不清細胞，你注意到?jīng)]有，當(dāng)把培養(yǎng)板那出孵箱一會，培養(yǎng)板蓋就有一層霧，會影響觀察細胞，你是不是這個問題？？
問：我在96孔培養(yǎng)板上接種的細胞很均勻，但換液時，我用槍加150ul的培養(yǎng)基加入每個孔內(nèi)，結(jié)果在顯微鏡下觀察周邊細胞全被沖到孔中央去了，而中間的細胞層疊成致密的團塊.請問這樣的細胞對實驗有影響嗎?有其他的好辦法嗎? 是3T3-L1前脂肪細胞，要進行誘導(dǎo)分化成成熟脂肪細胞。所以我每次換液總把握不好。請問有誰有這方面的經(jīng)驗嗎?
答：我們實驗室一般用機械吸引器吸引，吸引器管前面套一個20ul加樣器的Tip頭，效果不錯，操作在無菌臺內(nèi)進行。Tip頭剪去尖端后滅菌使用，加液時液體呈滴狀滴入，就不會擾動孔底的細胞了。
3T3-L1前脂肪細胞不是貼壁的嗎？怎么會這么容易被沖到中間去？
我只聽說過第一次把細胞加到孔中的時候很容易讓細胞長得不均勻，3T3-L1前脂肪細胞要是貼壁了不容易被沖走了吧，要不然就不要用胰酶消化了，呵呵??！
建議：加液的時候沿著邊輕輕的加入，動作柔和，可以避免沖動細胞；去液的時候直接甩板，方便快捷。
去液的時候不建議直接甩板，容易污染?？梢约舻魌ip尖，不能直接沖細胞，沿孔壁輕輕加入，液體提前在孵箱里預(yù)熱10分鐘，有時候液體涼也會使細胞掉下來。
是換完液馬上就卷了，還是過一會兒才卷的？我覺得這個細胞狀態(tài)不好的時候是容易卷的，我誘導(dǎo)后換維持培養(yǎng)液時細胞卷的很厲害，原來也以為是換液造成的，后來觀察了一下不是。你在仔細分析一下，一定是換液造成的馬？一般帖壁細胞換液時即使是沖也只是一小部分破掉，不會大面積掉下來的，我認為。
換完液馬上就卷了，細胞好象是一大片全掉下來拉，并在浮動，然后我第二天在看時就發(fā)現(xiàn)細胞全堆在中間，我也沒在意，繼續(xù)換液.但現(xiàn)在是我把細胞從培養(yǎng)箱里拿出來肉眼就能看到每個孔中間有一個小白點.我以為是污染了，拿到顯微鏡下看又不太像，自己感覺是細胞疊在一起長的太密了.因為能看到很致密的細胞團.而周圍的細胞輪廓很清晰，但不是很多.為這個實驗我已經(jīng)鋪了5塊96孔板了，真不想再這樣繼續(xù)盲目下去.
我在96孔板中誘導(dǎo)細胞換液一般采用半量換液，這樣細胞就不會被沖走了，至于換液的間隔與細胞有關(guān)，我誘導(dǎo)肝細胞是隔天半量換液。如果卷得特別厲害，很可能是細胞的問題，建議更新細胞株。
問：我的細胞對胰酶和ＥＤＴＡ不管用．高濃度胰酶可以，但細胞存活率不高．有沒有小的細胞刮匙，（或者自制刮匙的方法），可以用于９６孔板？（我在建細胞系，非得用９６孔板）．謝謝！
一般情況下細胞在一次性培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中貼壁較緊，都不太好消化，如果建系的話最好不用刮的方法，還是消化比較好！消化時以下幾點注意了嗎？
消化前用D-Hanks沖洗了嗎？可以沖洗2-3遍。
適當(dāng)增加胰酶濃度，提高胰酶PH值到8，減少消化時間應(yīng)該對細胞影響不大。消化時放入37度培養(yǎng)箱。
如果細胞還是消化不下來可加適量膠原酶，有的細胞對膠原酶敏感。
市場上有買細胞刮刀，但是我用過的型號不適用與96孔。我在做96孔單克隆時一般采用酶消化法。 同意上樓的說法，消化前將細胞用D-Hanks沖洗，有助與消化，另外胰酶的最佳消化條件是 pH 8.0，37度最好. 如果效果還是不太好的話，可以采用多次消化方法。
問：D-Hanks和PBS沖洗效果有何不同？我在胰酶消化前一直用PBS沖洗。
首先，D-Hanks和PBS沖洗細胞都可以的，我兩種都用過，不過嚴格來說我認為D-Hanks更好，因為我們的胰酶是用D-Hanks溶的，所以用D-Hanks不改變胰酶的消化環(huán)境。
第二個問題，完全可以不用wash，加入帶血清的培養(yǎng)基之后胰酶將完全沒有作用，我一般都是這樣做的，但是如果EDTA濃度太高的話就需要wash了！  
培養(yǎng)板的包被及相關(guān)問題：為了適應(yīng)不同的實驗需要，可對培養(yǎng)板用不同的物質(zhì)進行包被后使用，這其中有促進細胞黏附的，也有用于一些特殊檢測需要的。不同的實驗?zāi)康目赡芫唧w的方案亦不同，根據(jù)需要靈活掌握。
(一)多聚賴氨酸包被：
問：我要培養(yǎng)原代神經(jīng)細胞培養(yǎng)，要用多聚賴氨酸鋪細胞培養(yǎng)板，請問賴氨酸液怎么配，怎樣鋪扳子
答：配制0.01%的多聚賴氨酸: 首先買來sigma 公司的多聚賴氨酸，如是25mg，就需要250ml三蒸水，用移液管將 少量三蒸水加到多聚賴氨酸的小塑料瓶中，然后將溶解的多聚賴氨酸加到200ml左右三蒸水中，(已置燒杯中)。最后加三蒸水達250ml，過濾除菌分裝與小瓶中即可。保存于-20度，近期用的話可放于4度冰箱內(nèi)保存。 注意每一小瓶的量不要太滿，若20ml的瓶子，只裝15ml可，若太滿，放于-2度有可能會將瓶子弄碎，因凍后體積增加。(我就有這個教訓(xùn)) 另外燒杯，小瓶、移液管都要滅菌處理的，泡酸高壓什么的。我們用的是一種用注射器過濾的過濾器，一次性的。一個能最多有效 過濾200ml。
鋪板的操作:首先要在消毒實驗室，包括超凈臺，紫外消度20-30分鐘。消毒后30分鐘進入實驗室。事先準備100ml三蒸水，經(jīng)高壓滅菌處理。具體細節(jié)就不多說了。
首先打開板子，用消毒好的試管將0.01%的多聚賴氨酸加入每一孔中，大概每孔3-4滴吧。將板子蓋好放到培養(yǎng)箱中(37度 5%CO2)30分鐘。
取出板子，用吸管將多聚賴氨酸吸出。換吸管，加入三蒸水，沖洗三次，即將每孔內(nèi)加入三蒸水，沒過底，多點也行。再將水吸出來。反復(fù)三次。注意換吸管，要無菌操作的。
最后將鋪好的板子放于培養(yǎng)箱待用。
如果你做免疫組化，需要放小的玻片到孔內(nèi)，就在加多聚賴氨酸之前用無菌的鑷子將無菌的玻片夾到孔內(nèi)即可。
問：PLL的分子量有3-5萬，7-15萬，15-30萬幾種，應(yīng)怎樣選擇？？謝謝：）
答：我們養(yǎng)神經(jīng)細胞，用的是分子量3萬到7萬的pll 。
以PBS配成1mg/ml的母液，－20度保存。使用時，用高純度的蒸餾水稀釋成0.11mg/ml的使用濃度，過濾除菌，以50微升每平方厘米的量均勻涂于培養(yǎng)底物的表面，室溫下靜置5min，吸除多余液體，股風(fēng)吹干即可。
問：多聚賴氨酸包被培養(yǎng)板后看上去應(yīng)該是什么樣的？？
要做原代培養(yǎng)，為了促進細胞貼壁，擬用PLL包被培養(yǎng)板。
1.我買的是博士德分裝Sigma的10ml的那種，可是院子里搜了一下，有人說沒有做過細胞培養(yǎng)試驗，不確定能否用于細胞培養(yǎng)！！這怎么辦，不能用么？
2.我的方法是這樣的，取了0。5ml，加入5毫升滅菌去離子水后，分成6份0.9ml，6孔板里放上玻片（準備以后做免疫組化直接取片子的），一個孔一份，室溫5分鐘后吸掉液體，超凈臺內(nèi)吹干過夜。第二天D-Hank's液洗3遍，晾干，紫外線照一會兒再用。請問這樣做有沒有硬傷？？
3.包被好后的板底及玻片應(yīng)該是什么樣的呢？？我發(fā)現(xiàn)板子干了以后，上面有些白點點，一開始以為是水滴，后來發(fā)現(xiàn)不是。莫非是PLL，那也是不是太夸張了？？請問這種現(xiàn)象正常否？？
PDL有用于組化玻片包被的不能用于細胞培養(yǎng)，你在用前需先確定是細胞培養(yǎng)級的，細胞培養(yǎng)板用PDL包被完后是看不出什么的，如果有顆粒是PDL在配制是未完全溶解，可看一下說明書。
我包被完用無菌水洗板子2－3次，吹干后很干凈，以前用PBS洗，吹干后也發(fā)現(xiàn)有白點，考慮是PBS中的鹽沉淀。
(二)明膠包被：
問：在細胞原代培養(yǎng)時，在培養(yǎng)瓶里鋪明膠，國產(chǎn)的明膠也以可用嗎？它是用什么配置呢？還有怎么消毒明膠呢？請多指教，謝謝！
答：國產(chǎn)明膠不太好用，明膠可以用PBS溶液溶解，一般在100度煮15分鐘，趁熱分裝，分裝后放在4度，不要冰凍。
問：明膠消毒之后可以放置多長時間？還是現(xiàn)配現(xiàn)用呢？你說的分裝是指直接鋪在培養(yǎng)瓶嗎？如果不是的話，放在4度冰箱不是已經(jīng)固定了嗎？固定之后有怎么鋪在培養(yǎng)瓶呢？因為是沒做過實驗所以很不明白。

答：sigma 有現(xiàn)成的終濃度是2%的明膠，已消毒，買來即可使用，方便而且不貴，僅100多塊錢。4度時明膠是膠凍狀，室溫下放置20-30分鐘就可變成液態(tài)，說明書上建議使用的包被密度是5-10ug/cm2。

國產(chǎn)明膠就可以的，用去離子水配成1%即可?？梢砸淮闻?0ml或100ml。使用時取你所需量高壓滅菌即可。滅菌結(jié)束取出稍涼就可以鋪在培養(yǎng)瓶中。
問：明膠包板完畢后，培養(yǎng)皿要干燥呢還是保持濕潤？
答：明膠包被培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶24小時后， 將明膠倒掉，用培養(yǎng)基沖洗，就可以接種細胞了。
問：在園里搜索了一下關(guān)于明膠在細胞培養(yǎng)中的使用問題，還是有很多問題大家沒有詳細和標準的說明，現(xiàn)有幾個具體問題，請教各位戰(zhàn)友，
1.明膠溶液配置的問題:用無菌PBS配還是用去離子水配?我們實驗室有國產(chǎn)的明膠，很大一瓶的那種，能不能用于細胞培養(yǎng)?難道一定要用GIBCO 20ML即用型的?
2.明膠使用濃度的問題:有說0.1%，1%和2%的，我養(yǎng)的是內(nèi)皮細胞，應(yīng)該用哪種濃度呢?
3.明膠消毒的問題:有人說可以高溫高壓滅菌，有人說應(yīng)該要過濾。。。還有人說要先高壓再乘熱過濾?不會吧，到底要怎樣?暈啊~~~
4.明膠包被培養(yǎng)瓶的問題:有人說包被后置培養(yǎng)箱過夜，用時在棄溶掉的，加PBS和培養(yǎng)液沖洗。。也有人說包被后吹干30min-60min 。再加培養(yǎng)液沖洗即可用，到底怎么個做法啊
5.明膠包被后的培養(yǎng)瓶使用期的問題:包被后的培養(yǎng)瓶能夠用多久呢?有文獻說包被7天，干2-3天后放4度保存可以在兩周內(nèi)使用。
答：Q1.明膠溶液配置的問題
A1: 用去離子水來配即可。國產(chǎn)的行不行要去試驗，保險的就是買進口的。其實通常是買Sigma的gelatin粉末來配就好了，不用買配好現(xiàn)成的。配好的濃縮液可分裝放-20度長期保存，即將要用的濃縮液可放4度來備用。
Q2.明膠使用濃度的問題
A2:1%是濃縮母液的濃度，使用前才取適量稀釋成0.1%來包被。
Q3.明膠消毒的問題:
A3: Gelatin是用高溫高壓殺菌的， 其他你所說的方法也不是不能用， 只是沒必要。
Q4.明膠包被培養(yǎng)瓶的問題
A4:通常是包被1小時就夠了，然後吸乾，不需要清洗。因為你配gelatin溶液中並沒有含其他有害的物質(zhì)， 沖洗只是多了一道沒必要的工作。包被完要清洗是Collagen才需要的。
Q5.明膠包被后的培養(yǎng)瓶使用期的問題
A5.這個我不知道，但基本上是越快使用越好。由於包被的過程很快，所以我都是當(dāng)天包被， 在等的過程中可以去做其他的事，包被即將完成的前20分鐘就開始處理細胞，等細胞收下來包被也就做好了， 馬上就用。

0.1%的明膠適合大多數(shù)細胞培養(yǎng)時的包被，在四度放置不會出現(xiàn)凝膠狀。我參考的文獻說內(nèi)皮細胞用1％的明膠包被，也就是母液，它在四度放置時會適度凝結(jié)。我的內(nèi)皮細胞用1％的明膠包被效果我覺得還不錯。
不管你用包被1小時的方法還是包被4小時的方法，都最好從包被開始到使用的間隔不超過一天，包被的容器放置時間越長越不好。
(三)纖連蛋白（(Fibronectin， FN）包被：
因為課題需要，我要養(yǎng)人外周血來源內(nèi)皮細胞，得先用human fibronectin包被培養(yǎng)板。但是昨晚我看了個通宵，把園子里關(guān)于FN包被培養(yǎng)板的帖子大致瀏覽了一遍，反而越看越糊涂了——幾乎就是百家爭鳴的局面：
從稀釋融解開始，有人說不能用三蒸水，要用制藥用的純水，否則PH值不對會影響活力；有人說用PBS，有人說用加了尿素的PBS；母液的濃度一般說是1mg/ml，但是買來的FN一般就是1mg，按這個濃度配置母液只能得到1ml，這么小的量如何分裝??？
至于包被的濃度，差異更是很大，有人說各個公司的產(chǎn)品不一樣，還是以說明書上說的為準，是不是這樣?。?/span>
另外，包被的方法，有4度過夜的，有37度過夜的，有37度2至3個小時的，還有四度過夜或37度2至3個小時的……
我買的是ROCHE的1mg裝human fibronectin，用的是corning的24孔板，最后對各種方案進行了摸索，結(jié)果見下面的帖子。
剛剛又再看了一下濃度的問題，大致歸結(jié)為以下三種方案：
1.園子里大部分戰(zhàn)友用的還是50微克/毫升的濃度，室溫或37度下放置30至40分鐘。
2.我請教了有的人用的是10微克/毫升，4度過夜。
3.還有我見一篇文獻《成人外周血內(nèi)皮祖細胞分離和誘導(dǎo)分化》中南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)J Cent South Univ (M ed Sci) 　2005， 30 (5)上面寫的是1微克/毫升，37度過夜。
至此產(chǎn)生一個疑問：是不是這幾種方案都可行？濃度越高的，需要的溫度就越低，時間就越短，而最后達到的效果是一樣的？
如果真是這樣，那么以上3個方案是一個比一個便宜啊，那我干脆用第3方案得了？第1方案比第3方案貴了五十倍?。”鹊?方案也貴了五倍。
非得花那么多錢嗎？FN不便宜?。?/span>
各位戰(zhàn)友，我摸索了好幾次，總共試驗了以下方案：
1.50ug/ml，4度過夜；
2.10ug/ml，4度過夜；
3.50ug/ml，室溫下放置45分鐘至一小時；
4.10ug/ml，37度過夜；
5.1ug/ml，37度過夜。
現(xiàn)在養(yǎng)到了第四天，自我感覺貼壁效果最好的是方案4，而且該方案所用的FN還是方案2用過一次的，我把它回收了又重復(fù)利用，已經(jīng)經(jīng)過了一次凍融，按理說效果應(yīng)該下降了不少了，但是它的貼壁時間早，細胞多而且形態(tài)比較接近長梭形，還聚集形成了很多集落樣的結(jié)構(gòu)，如下圖：
至于溶解分裝，我是用滅菌注射用水1ml將其溶解為1mg/ml，然后分裝為八支EP管，負二十度保存。
我要用人纖連蛋白包被培養(yǎng)板養(yǎng)細胞，請問自己如何包被，有無其他方法可替代？
以10μg/μl的纖連蛋白(Fibronectin)于4℃包被培養(yǎng)板過夜，接種細胞就可以了。
我用羅氏的Fibronectin 1mg/瓶，說明書推薦：配成50ug/ml，包被用量5ug/平方厘米。室溫下包被40分鐘，然后吸掉多余溶液，注意培養(yǎng)板不能干掉，包被后立即使用，可用PBS沖洗，但沒必要。具體濃度可根據(jù)實際需要調(diào)整(1～5ug/cm2)
(四)刀豆蛋白A包被：
問：我現(xiàn)在進行胰腺細胞培養(yǎng)，需要用刀豆蛋白A（Concanavalin A）包被細胞培養(yǎng)板。卻不知如何使用。想請教各位：Con A用什麼溶液溶解、多大濃度、包被需要多長時間。
答：包被液：Buffer A 碳酸鹽緩沖液（PH 9.5 0.05M），Na2CO3.10H2O 0.107g ，NaHCO3  0.073g ，二蒸H2O 25ml
包被液：10 ml+100ul2%NaN3+50ug抗原（5ug/ml）每孔100ul 。
(五)肝素化：
問：如何肝素化培養(yǎng)皿或細胞培養(yǎng)板，用于細胞與全血的共同培養(yǎng) ？
答：用1250-2500 u/ml的肝素，濕潤培養(yǎng)皿或板，然后傾去既可。
(六)病毒包被：
問：我要做間接ELISA檢測抗體。要先把病毒包培養(yǎng)板，不知道怎么做！
答：我也沒做過， 但我覺得病毒事實上也是蛋白顆粒，，在物理性質(zhì)上與普通蛋白無異，因此我覺得就是一個普通蛋白的包板而已。用碳酸鹽緩沖溶液。。4度過夜就行。。。，。。。
首先將病毒用包被緩沖液稀釋成最佳濃度包被，四度冰箱過夜。次日用洗滌液洗滌3 次。再將一抗加入其中。最后加入酶標抗體。
最重要的一點，為防止病毒的擴散傳播，一般事先都滅活才包被。
(七)anti-CD3單抗包被：
問：soluble anti-CD3單抗包被培養(yǎng)板時用PH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋，請問PH9.6的碳酸鹽緩沖液的配方是什么。另外IL-2在培養(yǎng)體系中用U/ml和ng/ml，請問這如何換算。
答：包被液（pH9.6碳酸鹽緩沖液）：精密稱取碳酸鈉 0.32g ，碳酸氫鈉 0.586g ，加水溶解，定容至200ml。
U/m是細胞因子的活性單位，細胞因子作用于特定的靶細胞，影響靶細胞的生物活性或細胞增殖動力學(xué)，通過檢測靶細胞的生物學(xué)活性或細胞增殖動力學(xué)變化，可間接反應(yīng)細胞因子水平，所以生物學(xué)方法檢測結(jié)果表示為相對單位或生物活性單位，一般是通過與細胞因子標準品的所測結(jié)果進行對照得出生物活性單位。而ng/ml是一個濃度單位，是通過免疫學(xué)檢測方法得到的一個定量結(jié)果，檢測的是細胞因子以及與細胞因子有交叉抗原的細胞因子前體等，常用ELISA法，如多克隆抗體和單克隆抗體，識別不同表位兩種單抗的雙抗體夾心法。由于結(jié)構(gòu)和功能的不一致性，以及其它因素干擾，免疫學(xué)測定法和生物學(xué)測定法結(jié)果并不等同，所以兩種單位之間也是無法換算的。必要時，可同時進行檢測。
一）培養(yǎng)板的清洗和消毒
培養(yǎng)板一般為一次性使用，尤其在接觸了有毒、有害等物質(zhì)后更應(yīng)該處理后丟棄。但如果要反復(fù)使用則一定要進行正確的清洗和消毒，以保證細胞培養(yǎng)的效果。
問：只有紫外照射可以保證無菌嗎?可不可以從清洗方面做點工作?
答：看你什么用途了，一般貼壁生長的細胞用重復(fù)利用的培養(yǎng)板效果不是很好，因為培養(yǎng)板表層在生產(chǎn)時涂有一層促進細胞貼壁的物質(zhì)，在清洗后多半會失去。懸浮或是半懸浮生長的細胞還可以。
我們一般是先泡酸過夜，清洗干凈，三蒸水清洗，再用無水酒精浸泡清洗，再在工作臺里用無菌水過一遍，在蓋上蓋子在烘箱里烤干，待烤干后，打開在超凈工作臺里近紫外（距離紫外燈<２０ｃｍ）照射半個小時以上，效果很好，沒有污染過。
其實不管老板有錢沒錢，我們做實驗室尤其是預(yù)實驗或是摸條件時，我們一般都能省就省了，留點錢還不如買點好試劑呢：）
我們一般是先清洗干凈，泡酸過夜，三蒸水清洗，在蓋上蓋子在烘箱里烤干，待烤干后，有兩種選擇：1、在超凈臺里近紫外燈（距離紫外燈<3０ｃｍ）照射半個小時以上，六孔板一般半個小時，24孔板一個小時，96孔板時間更長，效果很好，沒有污染過；2、到放射科照Co60，照完了盡快用。
我們這里腫瘤細胞耐性很好，所以重復(fù)利用沒什么問題，如果原代培養(yǎng)比較嬌貴的細胞最好用新板子，也不是很貴。
我們的經(jīng)驗是:清洗后用消毒液浸泡，泡酸過夜，自來水反復(fù)沖洗，雙蒸水沖洗三遍，無塵環(huán)境晾干，用之前紫外燈照射半小時以上，效果很好。我們現(xiàn)在的窮同仁一直在應(yīng)用。
永久了也會變黃，因此如果做mtt或比色時是不能用的，在不熟悉細胞培養(yǎng)的時候可以先學(xué)學(xué)細胞記數(shù)，熟練了用新的，不過腫瘤細胞可以在舊板子上長得很好喲，原代的細胞比較難養(yǎng)，塑料的較好。
紫外的穿透能力很弱，板子紫外照射時是否將蓋子翻過來一起照射那？還有，細胞瓶紫外效果如何？
板子泡酸后和瓶子一樣的清洗方法清洗后，60度烤干，然后放在工作臺里（打開蓋子）用紫外線照射半小時以上，最好一小時或兩小時，蓋子同時反過來照。瓶子照射沒有效果，要用其他方法
同意樓上大家的意見。96孔和24孔板子在做完了后要先泡清洗計，在用棉花搽洗每個孔，這樣有些貼壁細胞才不會有細胞碎片的殘留，在做mtt是很重要，要不很不準的。后面就是沖洗，泡酸，3蒸水洗，紫外照射30－60分鐘，不要時間太長，這樣板子容易變色！但是如果是做MTT還是建議用新板子！舊板子做，結(jié)果不準！
泡酸時不要用剛配好的濃酸，因為那樣會把培養(yǎng)板表面促進細胞貼附的一層膜腐蝕掉，細胞就無法貼壁了。用酸泡完后用自來水清洗，再用蒸餾水清洗3－5次，然后泡在75％的酒精里（酒精用純的無水乙醇），用前在紫外線下照射1h。基本可保證95％以上無菌，用這些板做做預(yù)實驗是沒問題的。
1.鈷60照射適合大量的板同時滅菌，最好攢一箱，再送去滅菌。
2.紫外消毒適合少量的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板，比如培養(yǎng)板，將蓋打開，翻過來，連同板一起在紫外下照射2小時即可，事先不用酒精泡。
(二)方法討論
細胞培養(yǎng)板常用來進行不同的處理效應(yīng)觀察，有些檢測可能直接就在培養(yǎng)板中進行，這里面有些什么樣的經(jīng)驗或小竅門呢？
1．細胞培養(yǎng)與MTT
問:做MTT時，96孔培養(yǎng)板細胞濃度該是多少？
答:我覺得細胞的濃度并不需要那么精確，關(guān)鍵是接種于每孔的細胞數(shù)就大致處于同一水平。
比如我做MTT，起初用的細胞濃度為5000/ml，每孔100ul，培養(yǎng)3天觀察，發(fā)現(xiàn)細胞數(shù)太少，各孔OD值反面難于比較。后來我換用10000/ml，結(jié)果就很好。
當(dāng)然細胞數(shù)也不能太多，這其實取決于你細胞的生長速度，生長快的細胞，可接種濃度低點。這主要是使細胞增殖率不致受處理因素之外的其他因素影響，比如接觸抑制，營養(yǎng)競爭。
總之，做MTT時細胞數(shù)應(yīng)較低，目的就是為了排除其他因素的影響，以使每孔細胞生長情況盡可能地反映出處理因素的影響。
細胞接種的濃度和你的實驗?zāi)康?、要求、細胞種類、處理因素的特殊要求都有關(guān)系。沒有簡單的，每孔接種多少的一個標準。當(dāng)然，可以用樓上建議的濃度開始摸索。同時，注意腫瘤細胞核正常細胞的生長數(shù)度也不一樣，前者生長快，后者慢，細胞數(shù)的量也有講究。到底多少合適，得根據(jù)你的實驗具體要求來摸索。我做b16轉(zhuǎn)染時，因為脂質(zhì)體要求細胞融合度為30%-50%，曾經(jīng)沒孔接種過300-500個細胞，效果非常好，
問:我做的MTT為什么同一組的兩孔差別那么大呢？做了兩次都是這樣！
答:產(chǎn)生差別的原因有多種
1.在加細胞時，細胞沉淀下來，導(dǎo)致兩孔細胞數(shù)不同。我們通常用磁力轉(zhuǎn)子對細胞緩慢攪拌，時刻保持細胞處于懸浮狀態(tài)。
2.96孔板在培養(yǎng)箱中，由于濕度不夠，而培養(yǎng)箱由于具有一定的溫度，使得邊緣的孔水分蒸發(fā)較快，導(dǎo)致培養(yǎng)基中各種成分濃度變化增大，導(dǎo)致細胞狀態(tài)不同。對于這種現(xiàn)象，要保證培養(yǎng)箱中的濕度，減少開關(guān)培養(yǎng)箱的次數(shù)和時間。
對于生長較快的細胞，例如每12小時到24小時就傳代一次的細胞，應(yīng)該起始濃度低一些，我一般是96孔板每孔加10 4個細胞，培養(yǎng)液每孔加200ul。
有些細胞生長較慢，例如72小時才傳代一次，或者是原代細胞，起始濃度應(yīng)高一些，我一般是96孔板每孔加2X10 4個細胞，培養(yǎng)液每孔加200ul。
問:96孔板培養(yǎng)板能否代替酶標板測吸光度？是可以拆成一條一條的那種好還是不可以拆的好？
1.最好是用酶標板，因為96孔板的各孔透光性不一致;
2.拆成一條條的方便使用一些。
MTT法計數(shù)細胞的相對數(shù)，可以對96孔板培養(yǎng)的細胞在用藥物刺激后的直接計數(shù)；也可以把細胞制備成細胞懸液，加到96孔板中，然后加MTT孵育、計數(shù)。
所以，如果是前者，必須用培養(yǎng)板；如果是后者，可以用酶標板。平底的，酶標板好一些。
問：我的干預(yù)因素是乳劑（白色），對結(jié)果可能會有影響吧，如何才能減少這些干擾?
答：當(dāng)然可以用，如果你害怕干擾因素對實驗產(chǎn)生影響，那么建議你設(shè)定一空白調(diào)零孔，如100ul的培養(yǎng)基加上10ul的藥物，測定的樣品吸光度減去空白調(diào)零孔即可！
測單一時間點的OD值，直接在培養(yǎng)板里就是了。測不同時間點的，需要在不同的培養(yǎng)板里。細胞在培養(yǎng)板里側(cè)就是了。干擾因素可以測前離心一下。
問：看到很多討論說 96孔四周不做數(shù)據(jù)處理，那么還是要加細胞或培養(yǎng)基嗎？如果我把四周設(shè)為空白孔（不加細胞）作為陰性對照，可以用來調(diào)零或計算抑制率不？
答：可用只加培養(yǎng)基組作為正常對照組，來計算細胞生存率=給藥組MTT/正常組MTT×100%，余空可不加任何物質(zhì)?！　TT不同與做ELISA需要設(shè)立空白對照、陰性對照和陽性對照，這其中的空白對照一般用PBS，目的是去除板底效應(yīng)。
實際上，對于96孔板的細胞培養(yǎng)可以采取一個方法來改變出現(xiàn)誤差的情況，就是將你的分組打亂，不要讓你同一組的細胞集中排在一個區(qū)域，盡量打亂，就可以了
首先，分析原因，即必須知道在96孔板四周做數(shù)據(jù)處理會有什么影響。
因為96孔板的密封性比較良好，也就是說培養(yǎng)箱內(nèi)空氣中的O2是透過板四周很小的空隙進入培養(yǎng)板的，細胞代謝產(chǎn)生的CO2也是通過四周空隙從板內(nèi)排出來的。在板內(nèi)外氣體交換時，37度條件下，板內(nèi)的水汽也被大量帶出板外。這樣，就會造成96孔四周孔內(nèi)的體積減少，如果細心一點，就會發(fā)現(xiàn)外外周孔內(nèi)培養(yǎng)基的體積明顯小于內(nèi)部的體積。因此，如果最外一周有細胞進行培養(yǎng)，則會因培養(yǎng)基成分的濃度偏高而對細胞有影響，同時也會因為體積變化在做加入藥物干預(yù)實驗時，藥物濃度偏高而對測定結(jié)果有影響。
因此，在具體操作時，可以采用以下對策：
知道原因，我們可以跟據(jù)實驗情況選擇PBS或D－Hanks溶液，因為外周加入這種成本低廉的溶液，一方面可以減少內(nèi)部各孔中細胞培養(yǎng)液中水份的損失，另一方面，可以做為分析染菌等突發(fā)事故的原因，進行排查，找到染菌源頭。當(dāng)然，因為作MTT時，你本身會做空白對照與陽性對照，所以你可以完全不用管本底帶來的誤差了（建議你采用中間列6個孔為空白對照組，剩下共有9組54個孔，正好可以做三個藥，每個藥可設(shè)高、中、低三個濃度；加細胞時，你采用隨機加細胞法，反正60孔細胞你加滿就可以放心去培養(yǎng)了?。?/span>
2．細胞培養(yǎng)板與ELISA
問：請教各位，做ELISA能否用培養(yǎng)板呢，有什么差別呢？
答：應(yīng)該用ELISA試驗專用板子。細胞培養(yǎng)板是不行的。ELISA專用板條，是經(jīng)過處理的，要求每孔的均一性要好；而細胞培養(yǎng)板同樣經(jīng)過處理，但是是為了細胞更好地貼壁生長，使用細胞培養(yǎng)板可能會造成孔與孔之間的顯色沒有可比性。
所以，細胞培養(yǎng)板可以做要求不嚴格的定性ELISA實驗，而其他情況，應(yīng)當(dāng)使用正規(guī)ELISA板條。
問：大家的ELisa板有沒有重復(fù)利用啊，我們這里重復(fù)利用，但是沒有洗板機，就人工洗一下，然后煮沸，再烘干，不知這樣是否合理啊，我感覺還是新板的效果好些，還請高手指教！
答：細胞培養(yǎng)板用于定性或要求不是很高還可以，對于定量試劑最好用酶標板，可以提高均一性減少差異，而且強吸附酶標板還可以減少包被抗原或抗體的用量，因此最好用酶標板。
ELisa板一般不能重復(fù)利用。一是對板子均勻性的要求高，重復(fù)使用難達到。二是不劃算，一塊板子的試劑便宜的要幾百元，貴的要幾千元，而一塊空板貴的也就幾十元，便宜的還不到10元，再將樣本的價格和耗費的時間加上，而得到不靠的結(jié)果，你說應(yīng)該如何辦？
洗板機不是清洗重復(fù)使用板子的，而是在加樣過程中為了提高自動化程度洗板子用的（洗滌是ELISA實驗步驟之一）。
3．細胞培養(yǎng)板與免疫組化
問：在塑料的細胞培養(yǎng)板上，進行免疫組化應(yīng)當(dāng)怎樣合適，有沒有這樣的技巧？
答：完全沒有什么特別的，只是在最后封片的時候，有些不同。還有需要注意的是每一步加液體時應(yīng)從培養(yǎng)孔的壁上輕輕加上。使液體慢慢到達孔底，我第一次作時，沒注意到這一點，到最后細胞所剩無幾，所以雖是細節(jié)問題，但很重要 。

細胞培養(yǎng)板　Cell Culture Plates