【Merck & Millipore】Amicon? Ultra超濾管

——超濾法制備外泌體

截留精準(zhǔn) 高回收率

讓樣本制備如此簡(jiǎn)單

用膜進(jìn)行樣品處理的好處很多, 如操作簡(jiǎn)便, 效果穩(wěn)定可靠, 成本效益高等。超濾的性能依賴于對(duì)膜孔徑規(guī)格的嚴(yán)格工藝控制。超濾膜可截留1-1000kDa 的分子,鹽和水等小分子會(huì)透過,因此在大分子樣品處理中得到了廣泛應(yīng)用,包括截留樣品的純化、濃縮,及流穿樣本的處理等。

  默克Amicon? Ultra超濾管采用低蛋白吸附的Ultracel? 再生纖維素超濾膜,確保更精準(zhǔn)的截留分子量和更高的蛋白回收率。因其優(yōu)異的性能,Amicon? Ultra超濾管已被廣泛應(yīng)用于多種樣品制備的場(chǎng)景,包括蛋白/抗體/酶/核酸等生物樣本的濃縮、脫鹽和緩沖液置換、病毒/嗤菌體/外泌體/囊泡/微粒等樣本的純化、藥物篩選、藥物結(jié)合實(shí)驗(yàn)、蛋白富集、小分子物質(zhì)去除、分析樣品前處理等,為科學(xué)研究提供高效的創(chuàng)新方案。

Amicon? Ultra 超濾管的獨(dú)特優(yōu)勢(shì):

? 高回收率: 超濾膜的截留精準(zhǔn),非特異吸附低,>90%回收率

? 不易堵塞: 雙側(cè)豎膜設(shè)計(jì),不易堵塞,提高效率

? 避免污染: 熱封技術(shù),無粘合劑,防止溶出物污染

? 性能穩(wěn)定: —體化設(shè)計(jì),合理死體積,數(shù)據(jù)平行性、重現(xiàn)性好

? 廣泛兼容:  pH 3-13適用,化學(xué)兼容性好

Tips  “就地取材”快捷制備外泌體

外泌小體(Exosome)是—種囊泡結(jié)構(gòu),直徑通常在30-150nm,常見于正常體液和病理樣本,培養(yǎng)細(xì)胞也可分泌。研究人員已經(jīng)在血液、唾液、尿液、母乳等中發(fā)現(xiàn)外泌小體,其運(yùn)載的蛋白和核酸涉及其細(xì)胞間物資、信息交流,影響和調(diào)控著多方面的生理功能,包括腫瘤發(fā)生、免疫促進(jìn)、渦亡調(diào)控、血管生成、炎癥反應(yīng)及發(fā)育和分化等。由于在體液中出現(xiàn),外泌小體對(duì)于臨床生物標(biāo)志物檢測(cè)特別有利,成為體外診斷、biomarker研究的新熱點(diǎn)。

近年來隨著分離純化技術(shù)的提高,關(guān)于外泌小體的研究成果頗豐;這進(jìn)—步吸引了越來越多領(lǐng)域的課題將外泌體納入研究對(duì)象。研究的前提是方便、高效、標(biāo)準(zhǔn)化地分離純化外泌小體。經(jīng)過近20年的化外泌小體。經(jīng)過近20年的探索,已經(jīng)建立了超速離心法、沉淀法、色譜法、親和純化法等。在大量實(shí)踐中大家逐漸認(rèn)識(shí)到根據(jù)下游研究對(duì)樣品的要求,以及起始樣品的規(guī)模、數(shù)量,可以選擇不同的外泌體制備策略。因不需要特殊的設(shè)備和試劑盒,對(duì)操作人員也沒有特別的經(jīng)驗(yàn)要求,超濾法后來居上,成為實(shí)驗(yàn)室中制備外泌體的通用方法。 

參考方案

兩步法細(xì)胞上清的外泌體分離

操作步驟舉例

從細(xì)胞培養(yǎng)上清中制備外泌體

步驟一: 樣品澄清

1. 將培養(yǎng)基上清從培養(yǎng)瓶中轉(zhuǎn)移到50ml錐形管中

2. 旋緊 Steriflip? 組件(貨號(hào) :SCGP00525,0.22μm, PES膜)至樣品管頂部,打開樣品管末端

3. 倒置組件并固定在基座或架子上

4. 將調(diào)節(jié)真空源連接到Steriflip? 裝置側(cè)面的真空端口上。打開真空使溶液通過膜進(jìn)入空管。

5. 拆下Steriflip? 裝置并蓋上樣品。將過濾后的樣品保存在 4°C 或進(jìn)行囊泡富集。

   本離心超濾方案基于使用AU-15 超濾管(10 kDa MWCO, # UFC901024)處15 mL樣品。如果要使用不同的體積或超濾管規(guī)格(AU-0.5,AU-2或AU-4 mL),請(qǐng)參閱相應(yīng)的Amicon? Ultra 超濾管使用說明書。

步驟二: 超濾管平衡 

6. 向超濾管中加入2ml PBS,蓋上蓋子,在4,000xg的擺桶轉(zhuǎn)子中離心10分鐘。

? 對(duì)于AU-2和AU-4,可以使用相同的離心機(jī)轉(zhuǎn)速。如果要使用固定角度轉(zhuǎn)子,請(qǐng)查閱設(shè)備用戶指南以獲得適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)速和體積限制。

? 對(duì)于AU-0.5,樣品在可容納1.5 mL管的固定轉(zhuǎn)子中以14,000xg離心。

7. 移去超濾裝置底部未過濾的PBS,抽取收集管里的濾液

? 對(duì)于AU-2、AU-4和AU-15,可通過移液器去除濾液。

? 對(duì)于AU-0.5,可1000xg反轉(zhuǎn)離心2分鐘去除濾液,移除收集管中PBS或更換新的收集管。

步驟三: 樣品超濾     

8. 像AU-15超濾管中加入15ml 樣品,蓋上蓋子

9. 4,000xg離心30分鐘。

備注: 終產(chǎn)品體積通常大約500μL(30倍濃度),但根據(jù)樣品的性質(zhì)、流速和離心時(shí)間可能會(huì)有所不同。有關(guān)樣品體積和終體積的估計(jì),請(qǐng)參閱對(duì)應(yīng)Amicon?Ultra超濾管使用說明書。

10. 從離心機(jī)上取下超濾裝置,棄除收集管里的液體。

11. 往過濾裝置中加入14mL PBS,移液器輕輕吸吐多次。4,000xg離心30分鐘。

12. 從過濾裝置中回收濃縮樣品。

? 對(duì)于AU-2、AU-4和AU-15,可用移液器吸取樣品,并多次沖洗膜側(cè)壁(每側(cè)3-4次)以確保完全回收。

? 對(duì)于AU-0.5,將過濾器倒扣在干凈的離心管中。在2000xg下離心1分鐘,將樣品轉(zhuǎn)移到試管( 反向旋轉(zhuǎn) )。

13. 細(xì)胞外囊泡樣品準(zhǔn)備好進(jìn)行分析。

注意事項(xiàng)及補(bǔ)充提示

? 無血清樣品選擇3kDa孔徑是為了盡可能提高外泌體的回收率。

? 有血清樣品選擇100kDa/500kDa孔徑是為了盡可能去除細(xì)胞分泌蛋白以及血清成分中小于外泌體的白蛋白造成的影響。

? 研究者可根據(jù)樣品的粘稠程度,以及需要制備的目標(biāo)外泌體/囊泡/顆粒的大小分布來選擇和優(yōu)化超濾孔徑(3kDa/10kDa/30kDa/50kDa/100kDa),以便達(dá)到更好的得率和操作體驗(yàn)。

? 樣品體積大于30mL時(shí)可以考慮用超濾杯或Centricon plus-70超濾管,請(qǐng)注意攪拌式超濾杯在200mL以內(nèi)時(shí)吸附損耗可能較離心式超濾管略偏高。

? 如需進(jìn)—步提高特定外泌體的純度,可選用包被相應(yīng)抗體的磁珠進(jìn)行親和純化精制。

超濾法制備的外泌小體參考數(shù)據(jù)

多維度分析4個(gè)SH-SY-5Y 細(xì)胞系的外泌小體樣品(含或不含血清)

不同方法制備外泌小體產(chǎn)量比較