1.可溶性抗原或抗體吸附于固相載體而成為不溶形式，這是進(jìn)行酶標(biāo)記測(cè)定的基本條件。許多物質(zhì)可作為固相載體，如纖維素、交聯(lián)右旋糖苷、瓊脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應(yīng)板及塑料管。

2.包被所用的抗原必須是可溶性的，而且要求是優(yōu)質(zhì)和穩(wěn)定的制劑，純度和免疫原性要高。如果不純，由于抗原中所含雜質(zhì)就會(huì)競(jìng)爭(zhēng)固相載體上的有限位置，降低敏感性和特異性。此外還應(yīng)考慮到制備包被抗原不應(yīng)破壞其免疫學(xué)活性。

3.對(duì)某些抗原必須進(jìn)行提純，如病毒的組織培養(yǎng)和雞胚培養(yǎng)物以及病毒接種動(dòng)物的臟器等，它們當(dāng)中存在著許多非抗原的蛋白質(zhì)，必須設(shè)法除去，常用梯度超速離心或親和層析法提純，不經(jīng)提純是不能使用的。

4.用最適稀釋度抗原，包被固相載體不僅經(jīng)濟(jì)，而且可以克服前帶現(xiàn)象?？赏ㄟ^棋盤滴定法進(jìn)行測(cè)定，但用單項(xiàng)滴定法更為簡(jiǎn)便，其方法是將抗原進(jìn)行一系列稀釋包被微量反應(yīng)板，再用一定稀釋度的陽(yáng)性參考血清和陰性參考血清進(jìn)行孵育后洗滌，再加酶結(jié)合物進(jìn)行反應(yīng)，經(jīng)孵育洗滌后，加底物溶液顯色，終止反應(yīng)后分別測(cè)定OD值，選擇OD值≥1.0的那個(gè)抗原稀釋度為最適包被濃度。一般總是要選擇那個(gè)OD值稍大于1.0，而不選擇小于1.0的抗原濃度。陰性參考血清OD值要求<0.1-0.2。也就是要求陽(yáng)性參考血清和陰性參考血清的OD值有明顯差別。

5.抗原包被固相載體除濃度外，對(duì)時(shí)間、溫度、PH均有關(guān)系。溫度高（如37℃、45℃、或56℃），包被時(shí)間可縮短，溫度低可延長(zhǎng)包被時(shí)間。但為了方便起見，通常采用4℃包被過夜，可使抗原吸附得更加完全且均勻。在用聚苯乙烯或聚乙烯微量反應(yīng)板或塑料管作固相載體時(shí)，在堿性條件下（如0.1 mol/L、PH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋抗原）4℃包被過夜較為合適。但在某些試驗(yàn)中，如用LPS或毒素蛋白包被時(shí)，用PH 7.2-7.4 PBS稀釋才是滿意的。包被特異蛋白質(zhì)的濃度為1-10 ug/ml，而對(duì)某些病原微生物抗原以5-20 ug/ml較為合適，但均應(yīng)通過滴定。

1.應(yīng)注意分離血清時(shí)，血液要求放置室溫中凝固收縮，不宜置冰箱（4℃）中凝固，否則會(huì)使大部分IgM和少量IgG喪失活性。

2.為了使特異性結(jié)合的抗體量盡可能多，包被微量反應(yīng)板凹孔的抗原應(yīng)該稍微過量。

3.在孵育或洗滌過程中，已吸附的抗原可能有部份會(huì)從固相載體上被洗滌下來(lái)。從而使加入被檢血清中的特異性抗體以外的蛋白質(zhì)很可能會(huì)吸附到原來(lái)包被抗原凹孔的空白處，增加本底顏色，產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)。

4.在稀釋劑及洗滌劑中加入各種保護(hù)性阻劑可用來(lái)抑制非特異性蛋白的競(jìng)爭(zhēng)性吸附作用。

5.在稀釋劑和洗滌劑中所加的吐溫-20很重要。它不僅能消除非特異性的本底反應(yīng)，而且還可增加陽(yáng)性標(biāo)本的敏感度，這可能與吐溫-20能分離所吸附的非特異性物質(zhì)有關(guān)。目前采用的洗滌劑為PH7.4 PBS（含0.2‰KCL）加0.05%吐溫-20，如無(wú)吐溫-20，也可用吐溫故-40或吐溫-60代替。但吐溫-80本底較高，不宜應(yīng)用。